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Hippo信号通路与细胞增殖和器官大小相关,其下游转录辅激活因子YAP在多种癌症中作为重要的癌蛋白出现。基于前期预实验的结果,发现喹唑啉类衍生物可以调控Hippo信号通路,而且,许多研究结果也已经表明含喹唑啉结构或喹唑啉类化合物具有显著的抗癌及抗肿瘤活性。所以,本课题组在查阅并参考大量的文献后,在前期工作的基础上,设计合成出一系列毒性小、疗效高的喹唑啉类化合物。通过MTT比色法对所合成化合物进行体外抗肿瘤活性筛选,发现化合物3333对胃癌细胞呈现出显著的生物活性,且能够激活Hippo信号通路。因此,本论文针对此新型喹唑啉类衍生物3333对胃癌细胞的抗肿瘤作用机制进行深入探究以及进一步体内抗肿瘤活性的验证。具体方法及结果如下:1.通过MTT法检测该系列化合物分别对人胃癌细胞MGC-803、人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞HCT-116的抑制增殖活性。结果筛选出化合物3333对MGC-803的抑制作用最为显著,确定为目标化合物。2.通过MTT法检测化合物3333对胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901、HGC-27)的生物活性。结果显示,化合物3333以浓度依赖的方式显著降低上述三种胃癌细胞的存活率,而对人胃粘膜上皮细胞GES-1没有显著毒性。3.为了探索化合物3333是否能够激活Hippo信号通路,通过Western Blot检测相关蛋白的水平。结果显示,化合物3333使细胞MGC-803与SGC-7901中P-LATS和P-YAP的蛋白水平以浓度-时间依赖的方式逐渐上调,而该通路中的主要下游效应分子YAP蛋白水平逐渐下调,证明化合物3333能够激活Hippo通路。4.为了进一步验证化合物3333能够激活Hippo信号通路抑制下游效应分子YAP,通过核质分离实验及Western Blot分别检测细胞MGC-803与SGC-7901核、质中YAP蛋白水平的变化。结果显示,在3333的作用下YAP在细胞核中几乎不表达。表明3333明显阻断了 YAP由细胞质向细胞核的转移。5.为了探索3333负调控YAP对下游靶基因的影响,通过Western Blot和RT-qPCR检测了抗凋亡因子Bcl-2与促增殖因子c-MYC的变化。结果显示,化合物3333在mRNA水平上对Bcl-2和c-MYC的调控与蛋白水平上一致,均能使其下调,体现了化合物3333具有对胃癌细胞的抗增殖和促进凋亡的活性。6.为了验证化合物3333能够诱导胃癌细胞凋亡,利用流式细胞术(FCM)检测,结果表明,随着浓度的加大,细胞MGC-803与SGC-7901的凋亡率显著增加;DAPI荧光染色可以看出细胞核发生明显的表征变化;利用活死细胞检测试剂盒得知,随着化合物3333浓度的递增,死细胞数随之增多。通过Western Blot检测得知,以时间-浓度依赖的方式,凋亡执行蛋白Cleaved-caspase 7明显增加及其底物蛋白PARP出现显著切割,凋亡抑制蛋白XIAP与c-IAP1逐渐降低,综合这些结果表明,化合物3333能够上调促凋亡蛋白并下调凋亡抑制蛋白而诱导胃癌细胞发生凋亡降低存活率。7.凋亡有内源性凋亡和外源性凋亡,已经检测出作用于线粒体膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2的变化,为了验证化合物3333是否对线粒体途径产生影响,利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)分别处理细胞MGC-803与SGC-7901,FCM结果表明,随着化合物3333浓度的增加,两种细胞的线粒体膜电位逐渐降低;利用细胞线粒体分离试剂盒分别处理细胞MGC-803与SGC-7901及Western Blot检测结果显示,3333下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1,诱导cytochromec的释放,激活下游的caspase9,表明化合物3333是通过线粒体途径诱导胃癌细胞发生凋亡。8.MTT比色法、克隆形成实验及生长曲线结果均表明化合物3333具有显著的抗增殖活性。利用DNA含量检测试剂盒(细胞周期)分别处理细胞MGC-803和SGC-7901,FCM结果显示,细胞周期阻滞在G2/M期。但Western Blot检测的结果显示,调控G2期的蛋白CDK1,Cyclin B1,Cyclin B2并没有下调,而标志M期的磷酸化的Histone H3蛋白的表达量明显增多。说明化合物3333通过将胃癌细胞阻滞在M期而达到抗增殖的效果。9.建立裸鼠移植瘤模型进行体内实验,5-FU为阳性对照组,化合物3333给药组与阴性对照组相比显著降低了肿瘤体积与重量,有效的抑制了肿瘤的生长速度且对裸鼠体重并无明显影响;血生化指标结果显示,给药组与阴性对照组并无明显差异;通过TUNEL法检测发现给药组肿瘤组织中出现明显的凋亡并且Western Blot检测组织YAP,Bcl-2,c-MYC的蛋白水平均出现下调。这些结果进一步证实,化合物3333能够激活Hippo信号通路,并通过介导凋亡和周期抑制产生明显的抗肿瘤效果且毒副作用小,具有良好的应用前景。综上所述,在胃癌细胞中,新型喹唑啉类衍生物3333除能够激活Hippo信号通路抑制下游效应分子YAP的活性外,还能够通过线粒体途径诱导凋亡、有效的抑制细胞周期的发展。本论文探索并验证了此化合物能够激活Hippo通路,以及对胃癌细胞的促凋亡及抑制增殖的作用机理,以期为抗癌药物的开发及联合治疗方案提供有效的研究依据和理论支持。