本研究以增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）为靶标,分别设计构建茎部长度为21 bp、27 bp和29 bp的shRNA表达载体,通过转染细胞和显微注射对不同茎部长度的shRNA表达载体在小鼠细胞及个体水平的干扰效应做一系统的评估并优化条件,以期建立、提高并完善小鼠基因沉默技术体系,为小鼠个体水平的RNA干扰研究提供基础性数据和资料。1.从13.5 d的绿色荧光小鼠胎儿中分离培养成纤维细胞,胰蛋白酶消化法处理,经3~4 d培养,细胞即可铺满瓶底,比组织块法（6~8 d）所需时间短。细胞传代时,0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化耗时最短,细胞贴壁率较高。试验表明绿色荧光小鼠胎儿成纤维细胞最适合的培养液为DMEM（高糖）+10% FBS,并确定了其最佳G418筛选浓度为400μg/mL。2.以EGFP为干扰靶基因,设计茎部长度为21 bp、27 bp和29 bp的shRNA序列,然后分别连入psiSTRIKE表达载体中,酶切及测序结果证明shRNA序列成功的克隆进入表达载体中。3.将构建好的载体一部分借助脂质体转染小鼠胎儿成纤维细胞,另一部分直接注射入小鼠腿部肌肉,利用实时荧光定量RT-PCR对其荧光表达进行精确定量。细胞水平上,21 bp、27 bp和29 bp茎部长度shRNA表达载体分别使得目的基因表达降低到45%、32%、25%;21 bp最大沉默效应出现在转染后24 h,而27 bp和29 bp出现在48 h。肌肉注射使得靶基因的表达水平分别下降到原来的8.9%、9.7%、9.0%,不同茎部载体沉默效应无显著差异。4.以EGFP为干扰靶基因,分别构建了具有荧光标记的茎部长度为21 bp、27 bp、29 bp的一系列串联shRNA干扰载体。将构建的干扰载体利用脂质体法分别转染Vero细胞,荧光显微镜下观察EGFP表达变化,仅见少量细胞发出微弱荧光。利用实时荧光定量RT-PCR对不同转染组沉默效应进行定量分析,结果表明pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照组（pEGFP-C1）的4.3%、3.0%和6.9%。5.构建的不同茎部长度串联shRNA干扰载体分别注射小鼠腿部肌肉,实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析,结果表明pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒（pEGFP-C1）的2.5%、1.3%和5.1%。6.小鼠胚胎原核显微注射干扰载体后进行体外培养,发育多数阻滞在二细胞期,此时荧光显微镜下可观察到明显的荧光减弱现象。本试验共注射受精卵1192枚,注射后存活763枚,存活率64%。在移植的44只母鼠中,仅有23只怀孕,中途流产21只,最终顺利产仔一窝。7.通过尾静脉注射将构建的干扰载体导入小鼠体内以初步评价其负效应,小鼠在注射后两个月内,均未见死亡及其它不良反应。PCR检测发现试验小鼠体内有目标基因的整合。8.转基因小鼠后代经PCR检测,共有5个阳性。