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背景及目的我国是乙型病毒性肝炎高发地区,人群HBV携带率尤其较高,最终发展到乙型肝炎肝衰竭几率较大。乙型肝炎肝衰竭多是在慢性乙肝病毒感染的过程中短期内出现的大量肝细胞坏死,肝功能衰竭。因其病情发展迅速,病死率高,目前对该病尚无有效内科治疗。肝移植是治疗的最终方案,而目前我国面临严重的供体短缺和移植价格高昂等问题。因此,乙型肝炎肝衰竭因严重影响人民的身体健康而一直受到临床医生和研究者重视。目前肝细胞移植一直是研究热点,各国学者通过不同途径试图探究能用于治疗性移植的肝细胞。与其他途径的细胞学治疗相比较,经基因学改造的原代肝细胞具有遗传背景和生物学功能与正常肝细胞最相似,且恶变几率较小,遗传性状易于保持等优点。但原代肝细胞存在培养困难,寿命短,难以传代,转染率极低等局限性,所以,基因经慢病毒介导感染细胞,实现稳定转染十分必要。存活素(survivin)是目前发现最强的凋亡抑制因子,目前现有研究均提示survivin与细胞增殖和细胞周期调控存在一定关系。对此,我们选择构建pGC-FU-survivin慢病毒质粒,以期在下步实验中利用survivin蛋白的表达影响原代肝细胞的增殖。方法1.从高表达survivin的小鼠淋巴瘤细胞株YAC-I中获取存活素(survivin)基因,连接到pcDNA3.1(+)质粒上,双酶切及双向测序鉴定。2.构建pGC-FU-survivin慢病毒载体,从基因水平和蛋白质水平鉴定含有survivin的目的片段表达。经包装,纯化,获得滴度较高的病毒颗粒进行下一步生物学功能研究。3.将病毒感染小鼠原代肝细胞结果1.双酶切及测序证实从YAC-I中获得的survivin基因连接到pcDNA3.1(+)质粒上,除第317位碱基由腺苷酸突变为胸腺嘧啶外,其余都与NCBI基因文库中survivin基因切合,该突变不影响蛋白质空间结构及蛋白质生理功能。2.构建好的pGC-FU-survivin表达质粒的阳性克隆菌株转染293T细胞后荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Western-Blotting结果见一与标准品大小相同的条带。在293T细胞中进行病毒包装,最终纯化出pGC-FU-survivin慢病毒颗粒。3. pGC-FU-survivin质粒可成功感染小鼠原代肝细胞,但因感染率仍未达到满意要求,目前仍在改进。结论借助T载体及pcDNA3.1(+)质粒,成功在pGC-FU慢病毒表达质粒上建立了pGC-FU-survivin慢病毒表达质粒。