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目的:表达叉头蛋白分子3（forkhead box protein 3,Foxp3）的调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）是T细胞的重要亚群,包括胸腺产生的tTreg（thymus-derived Treg,tTreg）和外周产生的pTreg（peripherally-derived Treg,pTreg）,主要功能是抑制效应T细胞增殖和炎症因子产生,建立自身抗原耐受,调节免疫应答,维持免疫系统的平衡。Treg数量或功能的异常改变会破坏免疫系统的稳态,引起自身免疫性疾病或者癌症的发生。多项研究表明,Treg的分化发育和功能维持与转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）信号通路密切相关。而E3泛素连接酶神经前体细胞表达发育下调的4样蛋白（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-like,NEDD4L）通过泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）降解TGF-β信号通路中的I型受体和Smad2/3,调节TGF-β信号传递。本课题通过构建Foxp3GFP小鼠T细胞定向敲除NEDD4L基因模型,分析NEDD4L对Treg的比例和表型的影响,初步探讨NEDD4L在自身免疫病和肿瘤治疗等领域的潜在价值。方法:1.建立Foxp3GFP小鼠T细胞定向敲除NEDD4L基因模型将FoxP3GFP和NEDD4Lf/f这两种小鼠杂交,获得FoxP3GFPNEDD4Lf/f转基因小鼠,再将FoxP3GFPNEDD4Lf/f小鼠与Lck-Cre+/-小鼠杂交,最终获得野生型(WT:Lck-Cre-/-FoxP3GFPNEDD4Lf/f)和敲除型(KO:Lck-Cre+/-FoxP3GFP NEDD4Lf/f)小鼠。取FoxP3GFP小鼠的脾脏,制备单细胞悬液,进行表面染色和核染色,使用流式细胞分析仪检测并比较GFP和Foxp3的表达水平,确定两者表达的一致性。通过Western Blot和聚合酶链式反应鉴定WT和KO型小鼠。2.NEDD4L对胸腺中T细胞群体的影响取9-11周小鼠称取体重,并分离其胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结,称重拍照,观察WT和KO小鼠形态和重量的差异。制备胸腺单细胞悬液。流式细胞仪分析各阶段T细胞和Treg的比例以及Treg细胞Foxp3的MFI。3.NEDD4L在T细胞中的缺失对外周Treg的影响制备脾脏、外周血和肠系膜淋巴结单细胞悬液,流式细胞仪检测外周CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg的比例和绝对数以及Treg细胞Foxp3的MFI。流式细胞仪分析脾脏中Treg表面分子CD25、CD44、CD69、CD103、GITR、PD-1和CTLA-4的表达水平。4.NEDD4L缺失对体外T细胞活化后Treg群体的影响（1）将WT和KO小鼠的脾脏的单细胞悬液以1×106/孔的细胞密度接种于96孔板中经anti-CD3/anti-CD28活化,37℃、5%CO2细胞培养箱培养72-96h后收集细胞进行细胞表面染色,流式细胞仪分析Treg比例和Foxp3的MFI。（2）制备WT和KO小鼠脾脏单细胞悬液,通过磁珠分选获得CD4+T细胞,以每孔5×105的细胞数接种于96孔板,anti-CD3/anti-CD28活化,细胞培养箱培养72-96h后收集细胞,流式细胞仪分析Treg比例和Foxp3的MFI。（3）取小鼠脾脏细胞,经磁珠分选获得na?ve CD4+T细胞,以每孔3×105的细胞数接种于96孔板,anti-CD3/anti-CD28活化,添加TGF-β和IL-2诱导,细胞培养箱培养72-96h后收集细胞,流式细胞仪分析Treg比例和Foxp3的MFI。结果:（1）Foxp3GFP小鼠T细胞定向敲除NEDD4L基因模型构建成功;聚合酶链式反应准确鉴定出WT和KO小鼠基因型;流式细胞术检测结果显示Foxp3GFP小鼠的Foxp3和GFP表达水平相一致;Western Blot成功从蛋白水平鉴定出WT和KO小鼠胸腺中NEDD4L的表达。（2）WT和KO小鼠体重无明显差异;胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结的形态、重量和细胞总数亦无明显差别;胸腺中各阶段T细胞比例绝对数均相似;胸腺中Treg数目比例及Foxp3的MFI无明显差异。（3）NEDD4L基因缺失引起外周Treg细胞比例升高,然而Foxp3的MFI未受明显影响;脾脏和肠系膜淋巴结中CD8+T淋巴细胞比例降低,T细胞数目减少;外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞比例降低;脾脏中Treg活性相关表面分子CD44、CD69、CD103和功能相关表面分子GITR、PD-1和CTLA-4的表达水平增高。（4）T细胞缺失NEDD4L后全脾细胞体外活化和磁珠分选的CD4+T细胞体外活化后Treg比例升高;Treg体外分化实验中Treg的比例未有明显影响。结论:UPS中的E3泛素连接酶NEDD4L参与调节胸腺外Treg细胞的比例和表型;NEDD4L在维持胸腺外Treg和其他T细胞之间的平衡中发挥重要作用。