论文部分内容阅读
肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是肾脏中最常见的恶性肿瘤,其发病率和致死率一直都居高不下,肿瘤标志物的开发对RCC的早期诊断和治疗都有重要的意义。人SLC4 7A2(Solute carrier family 47,member 2)基因编码多药及毒素外排转运蛋白(Multidrug and toxin extrusion protein 2,MATE2),主要在肾脏中表达。我们通过研究RCC患者肿瘤组织及其配对正常组织中SLC47A2基因的表达发现在RCC肿瘤组织中SLC47A2基因mRNA的转录水平几乎沉默,蛋白水平也明显降低,有望成为一个新的RCC早期诊断标志物。表观遗传学因素在基因的转录调节中发挥了重要的作用,许多肿瘤的形成以及生物标志物的出现与表观遗传修饰密不可分,DNA甲基化和组蛋白修饰是两大重要的表观遗传调节机制。首先,通过对比RCC肿瘤组织和配对正常组织中SLC47A2基因启动子CpG岛上DNA甲基化水平发现两者之间并不存在差异,表明启动子CpG岛甲基化与该基因在RCC中转录抑制无关,进一步采用DNA甲基化酶抑制剂DAC(5-Aza-2’-deoxycytidine)处理肾癌细胞系发现SLC47A2基因也不能被诱导,排除了其它位点DNA甲基化对该基因的调节。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)比较RCC肿瘤组织和配对正常组织中组蛋白修饰的差异,发现转录激活相关修饰H3K4me3和转录抑制相关修饰H3K27me3在正常组织SLC47A2基因启动子转录起始位点(TSS)附近都有明显的富集,表明SLC47A2基因是一个典型的双价基因,而H3K4me3在肿瘤组织中富集的减少提示这种双价基因的调节机制与SLC47A2基因的转录抑制相关。另外组蛋白乙酰化修饰H3K27AC和H4AC在肿瘤组织中的富集均低于正常组织,与肿瘤组织中SLC47A2基因表达的降低一致。然后,以肾癌细胞系为模型研究相关组蛋白修饰与SLC47A2基因表达之间的关系,阐明RCC患者肿瘤组织中SLC47A2基因转录抑制的机制。研究显示,组蛋白甲基化转移酶MLL1能够激活SLC47A2基因的转录活性,而MLL1表达的减少会降低SLC47A2基因启动子TSS附近H3K4me3的修饰水平,并降低SLC47A2基因表达。肿瘤组织中检测到SLC47A2基因启动子TSS附近MLL1的富集低于正常组织,推测是SLC4 7A2基因转录抑制的原因之一。降低PRC2(Polycomb repressive complex 2)蛋白复合物成员EZH2的表达可减弱SLC47A2基因启动子TSS附近H3K27me3的修饰,并诱导基因的表达,说明H3K27me3也参与调节SLC47A2基因的表达。在组织和细胞中均发现SLC47A2基因具备双价特征的情况下,只需通过调整H3K4me3或H3K27me3的修饰水平就能够改变自身表达,而非需要其中一个修饰完全丢失然后由剩下的那个修饰来控制表达。综上,SLC47A2双价基因的表达水平取决于H3K4me3/H3K27me3的比例。最后,通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(trichostatin A)处理肾癌细胞系研究组蛋白乙酰化修饰对SLC47A2基因表达的影响。研究发现,TSA在增强SLC47A2基因启动子TSS附近组蛋白乙酰化修饰H3K18AC、H3K27AC和H4AC的同时,可以增强组蛋白甲基化H3K4me2和H3K4me3的修饰水平,并显著诱导该基因的表达;组蛋白去乙酰化酶(HDACs)与SLC47A2基因的转录抑制相关,HDAC10负责移除SLC4 7A2基因启动子TSS附近组蛋白乙酰化修饰H3K18AC和H3K27AC,并且同样对H3K4me2和H3K4me3的修饰起到抑制作用。这些结果表明HDAC10在调节组蛋白乙酰化修饰的同时也调节了组蛋白甲基化修饰,进而抑制SLC47A2基因的表达。研究还证明,转录因子E2F1与HDAC10存在相互作用,并调节组蛋白修饰。因此我们认为RCC肿瘤组织中SLC47A2存在以下调节机制:E2F1招募HDAC10至SLC47A2基因的启动子上,在降低组蛋白乙酰化修饰的同时影响组蛋白甲基化修饰酶的富集,从而降低组蛋白甲基化修饰水平,最终引起SLC47A2基因的转录抑制。鉴于组蛋白去乙酰化酶对SLC47A2基因的调节作用,因此,在临床应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂时应考虑这一效应产生的副作用。综上所述,本文阐明了 RCC中SLC47A2基因的转录抑制及其组蛋白修饰的部分调节机制,增加了人们对RCC的了解。SLC47A2基因在RCC肿瘤组织中显著降低,有可能成为一个新的RCC早期诊断标志物,并为RCC治疗药物的开发提供潜在的作用靶点。