湖北某斑点叉尾鮰苗种场暴发斑点叉尾鮰出血病,患病鱼症状为鳍条基部、下颌、鳃盖、眼眶周围出血,眼球突出,腹部膨胀。肝、肾失血,脾脏肿大,呈黑红色。肌肉组织有出血瘀点。该病主要危害体长6-14cm的斑点叉尾鮰鱼种,死亡率高达60%以上,造成严重经济损失。斑点叉尾鮰出血病的病原为斑点叉尾鮰呼肠孤病毒,属水生呼肠孤病毒属成员。本研究建立了斑点叉尾鮰呼肠孤病毒的培养方法,该病毒可感染斑点叉尾鮰肾脏细胞系并稳定传代,病毒滴度较高为10-8-67/m1。通过病毒滴度测定,证明反复冻融对病毒滴度无明显影响(P>0.05)。本研究查明了斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)感染斑点叉尾鮰肾脏细胞(CCK)诱导其发生凋亡的机理。以CCRV感染的CCK细胞为实验材料,采用Hoechst33258染色、DNA片段化检测、TUNEL反应、亚G1期细胞检测以及线粒体膜电位变化检测等方法进行实验。感染试验结果显示,病毒感染斑点叉尾鮰肾脏组织细胞后,细胞变圆、皱缩、折光度增加,随后细胞脱落,细胞单层呈网状,感染72h后出现典型细胞病变效应(CPE)；病毒感染72h后Hoechst33258染色结果显示,细胞的染色质固缩、核边缘化或破裂,可观察到凋亡小体,细胞凋亡率随时间增加；DNA片段化检测结果显示,病毒感染细胞12h后细胞基因组DNA出现片段化,随后逐渐增强,72h达到最高；YIINEL反应结果表明,病毒感染细胞72h后细胞基因组DNA断裂,有大量游离3’末端自由羟基(-OH)存在。亚G1期细胞检测结果显示,病毒感染48h后,约53.44%细胞处于亚G1期；利用JC-1检测试剂盒检测病毒感染细胞的线粒体膜电位变化,病毒感染细胞24h后线粒体膜通透性发生改变,膜电位变化显著。紫外线灭活与热灭活的斑点叉尾鮰呼肠孤病毒不能诱导斑点叉尾鮰肾脏细胞发生凋亡,表明细胞凋亡依赖于病毒复制。