论文部分内容阅读
第一部分LRIG3基因过表达对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原和Ki67表达的影响目的：探讨过表达LRIG3基因对神经胶质瘤细胞系U251与U87增值及PCNA和Ki67表达的影响及其机制。方法：用携带LRIG3基因过表达特异性序列和只含空白载体的重组质粒分别用慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251MG与U87,筛选稳定株,分别分成实验组和对照组,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞LRIG3表达量的变化,应用四唑蓝比色实验(MTT)检测病毒感染细胞导入LRIG3后对胶质瘤细胞系U251MG与U87增殖的影响,用免疫组化SABC法分别检测各组细胞中PCNA和Ki67表达差异。结果：LRIG3过表达组细胞中,LRIG3mRNA水平与对照组相比较分别上67.6%(U251)和79.9%(U87),LRIG3蛋白表达水平分别升高91.0%(U251)和62.3%(U87).MTT法结果显示两实验组细胞增值率均低于相应的对照组。U251细胞对照组PCNA阳性率为(47.81±4.67),实验组为(27.49±3.17),U87细胞对照组PCNA阳性率为(55.5±4.01),实验组为(33.6±4.82),差异均有统计学意义(P<0.05)。U251细胞对照组中Ki67的阳性率为(48.5±6.11),实验组为(24.3±3.76),U87细胞对照组Ki67阳性率为(55.2±4.19),实验组为(23.5±4.60),差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：LRIG3基因过表达可减低胶质瘤细胞株U87和U251的增殖。第二部分过表达LRIG3对脑胶质瘤细胞周期,侵袭和迁移等生物学特性的影响及其在信号通路中的作用机制目的：本研究旨在探讨过表达LRIG3基因对脑胶质瘤细胞U251与U87细胞周期、凋亡、侵袭能力等的影响及分子信号通路机制。方法：将过表达LRIG3质粒和空白质粒经慢病毒法感染胶质瘤细胞,筛选稳定株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG3及其他蛋白表达的变化,应用细胞流式法(PI单标)测定细胞周期变化,软琼脂法检测细胞增殖；Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,划痕法检测细胞迁移,用免疫组化原位末端标记法检测各组凋亡细胞数量差异。结果：与对照组相比,LRIG3过表达组U251MG与U87细胞中LRIG3 mRNA水平较分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高134.1%和3.3倍。流式法结果显示实验组细胞G0/G1期高于对照组,有统计学意义(P<0.05)。Cyclin D1表达下降。克隆形成增多。Transwell小室法结果显示实验组细胞通过ECM胶的数量明显少于相应的对照组,TUNEL染色结果显示对照组U251细胞阳性率为23.4%,实验组为35.7%,对照组U87细胞阳性率为20.2%,实验组为39.5%,差异均有统计学意义(P<0.05)。LRIG3的上调抑制下游的细胞内信号,表现显著下降的表达水平的p-ERK1/2, p-AKT。基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的表达在LRIG3过表达细胞中有所降低。LRIG3过表达导致C-myc, ErbB家族基因表达下降。我们研究还显示在LRIG3过表达细胞在脑胶质瘤细胞基础的情况持续刺激条件下,细胞中的磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)水平和Akt都大幅度减少。结论：LRIG3基因过表达能通过抑制ERK和Akt的磷酸化来阳.断细胞周期于G0/G1期,降低胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力,加速细胞凋亡,最终抑制胶质瘤的发生和发展。