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癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)作为一种广谱性肿瘤标志物,对于癌症的早期诊断具有非常重要的意义。因此,学者们对用于CEA检测的高灵敏度和准确度的传感器展开了广泛研究。但是,当前研究仍然存在一定的局限性:第一,在应用广泛的免疫传感法中使用的抗体易失活且合成重现性差;第二,核酸适配体相较于抗体具有更多优势,但是其亲和力还有待提高;第三,酶标记的传感器具有较高的检测灵敏度,但是它的共价修饰较为昂贵、复杂且耗时;第四,目前开发的CEA传感器还难以集灵敏、准确、简单、稳定、快速、经济等优势为一体。目的:本研究旨在利用核酸适配体替代抗体,并通过分子模拟技术对经过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选到的CEA亲代适配体进行重筛选以提高适配体的亲和力,进而利用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)的自然属性、以及核酸适配体和纳米材料的独特性质,构建出可以集灵敏、准确、简单、稳定、快速、经济等优势为一体的免抗体CEA传感器。方法:1.基于刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)与糖残基特异结合的性质构建无标记夹心电化学适配体传感器灵敏检测CEA用凝胶电泳实验验证ConA与糖蛋白(CEA和HRP)的结合;用循环伏安法(Cyclicvoltammetry,CV)和电化学阻抗图谱技术(Electrochemicalimpedance spectroscopy,EIS)对电化学适配体传感器的组装过程进行表征;用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)优化该传感器组装过程的实验条件,并探究该传感器对CEA检测的灵敏度、线性范围、特异性、可重复性、稳定性以及在人血清样本中的适用性。2.基于计算机分子模拟技术对SELEX筛选到的CEA适配体进行重筛选在SELEX筛选到的亲代CEA适配体的基础上通过碱基置换和插入策略构建DNA突变序列库;用Mfold预测突变序列的二级结构,用RNAComposer和MOE软件预测和优化突变序列的三级结构;用ZDOCK模拟突变序列与CEA的对接模型并预测它们之间的结合能力;用生物膜干涉技术(Biolayer interferometry technique,BLI)测定初步预测到具有更高ZDOCK打分的CEA适配体对CEA的亲和力;用最终筛选到的具有更高亲和力的适配体组装适配体传感器,并探究它们在传感器中的应用性能。3.基于中空金纳米颗粒(Hollow gold nanoparticles,HGNPs)和HRP的双重信号放大作用,并基于磁珠的快速分离特性以及适配体的结构转换特性,构建适配体传感器快速、灵敏、多模式检测CEA通过银模板化学置换反应合成HGNPs,分别用紫外-可见(UV-vis)光谱法、高分辨透射电子显微镜(High-resolution transmission electron microscopy,HRTEM)和能量色散系统(Energy dispersive system,EDS)对HGNPs的特性进行表征;用UV-vis光谱法、场发射扫描电子显微镜(Field emission scanning electron microscopy,FESEM)和 X 射线能量色散谱仪(Energy dispersive X-ray detector,EDX)对传感器的组装过程进行表征;用DPV法对传感器组装的实验条件进行优化;最后,考察该传感器在比色法检测模式下对CEA进行半定量检测、以及在UV-vis光谱和DPV检测模式下分别对CEA进行定量检测的性能,并在DPV检测模式下探究该传感器对CEA检测的特异性、可重复性、稳定性以及在人血清样本中的适用性。结果:1.基于ConA构建无标记夹心电化学适配体传感器灵敏检测CEA凝胶电泳结果表明ConA可以与CEA和HRP结合形成复合物。CV和EIS的结果证明在传感器的组装过程中,相应的分子都成功地结合在了电极表面。在最优的实验条件下,电化学检测信号随着CEA浓度的增加而增大,在5 ng/mL到40 ng/mL范围内呈现良好的线性关系,最低检测极限(Limit of detection,LOD)为3.4ng/mL,低于癌症患者血清中的阈值(10 ng/mL)。构建该无标记免抗体电化学夹心适配体传感器实现了对CEA的灵敏检测,同时展现出了非常好的特异性、可重复性、稳定性以及在人血清样本中的适用性。2.基于计算机分子模拟技术对SELEX筛选到的CEA适配体进行重筛选通过基于计算机分子模拟技术重筛选的方法,我们筛选得到两条ZDOCK打分显著高于亲代适配体(P)的DNA突变序列(P-ATG和GAC-P);应用BLI测得它们的解离常数分别为4.62nM和3.93 nM,显著优于亲代适配体(6.95nM);由它们组装的基于ConA的无标记免抗体适配体传感器对CEA的LOD分别为1.5 ng/mL和1.2ng/mL,也显著低于由亲代适配体组装的传感器(3.4ng/mL)。3.基于HGNPs和HRP构建适配体传感器快速、灵敏、多模式检测CEAUV-vis光谱结果显示HGNPs的表面等离子共振位置覆盖了整个可见光区域乃至近红外区域,HRTEM和EDS的结果显示HGNPs是具有中空多孔结构的Au/Ag复合纳米颗粒。UV-vis光谱法、FESEM和EDX的结果证明适配体传感器的成功组装。在最优的实验条件下,通过比色法就可以轻易区分不同的CEA水平,在UV-vis光谱法和DPV法两种检测模式下,对CEA的检测线性范围分别为 10 到 250 ng/mL 和 2 到 250 ng/mL,LOD 分别为 8.6 ng/mL 和 0.78 ng/mL。而且,在仅45min内就可以完成检测。构建的该适配体传感器实现了对CEA的快速、灵敏和多模式检测,同时具有非常好的特异性、可重复性、稳定性以及在人血清样本中的适用性。结论:本研究利用Con A与糖蛋白特异性结合的特性,开发了一种新型的基于ConA的无标记免抗体电化学夹心适配体传感器,实现了对CEA的灵敏、稳定、简单和低成本检测。之后,为了提高传感器的检测灵敏度,我们开发了一种基于计算机分子模拟技术对CEA适配体进行重筛选以提高适配体亲和力的方法,并成功筛选得到两条具有更高亲和力的CEA适配体,它们在传感器的应用中也表现出了更好的CEA检测性能。最后,我们利用磁珠的快速分离特性以及适配体的结构转换特性,开发了一种基于HGNPs和HRP双重信号放大的适配体传感器,实现了对CEA的快速、灵敏和多模式检测,该适配体传感器还具有准确度高、稳定性好、操作简单等优势。总之,在本研究中,我们使用核酸适配体替代抗体,并成功地提高了 CEA适配体的亲和力,而且也实现了酶的非共价修饰。最终开发出了集灵敏、准确、简单、稳定、快速、经济以及多模式检测等优势为一体的适配体传感器,成功地解决了目前CEA传感器存在的一些问题。