手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种全球性的传染性疾病,主要发生在以亚太地区为主的发展中国家。中国自1981年在上海第一次发现手足口病案例后,全国范围内多次爆发手足口病疫情,鉴于其发病数为丙类传染病之首,被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。引起手足口病的病原体为小RNA病毒科(Picornaviradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。依据流行病学调查研究发现,其中最为常见的病原体为肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇A16型(Coxsackie A16,CVA16),约占总发病人数80%以上,感染对象主要为5岁以下的儿童,约占总发病人数的90%。临床研究发现,感染EV71后有时会诱导发生一系列严重的神经性疾病,甚至会导致儿童死亡,而CVA16型感染导致的临床症状较温和。目前临床上尚未有针对严重手足口病发生的有效治疗性药物,因此预防性疫苗的研制与接种作为控制手足口病发生的重要手段显得至关重要。鉴于手足口病已经成为公众健康的重要隐患问题,而病原体EV71具有大规模爆发性和严重的嗜神经性,目前EV71已成为当前手足口病研究领域的重点研究对象。本文将以EV71病原体作为手足口病基因工程疫苗的主要研究对象。目前,HFMD疫苗以灭活疫苗和病毒样颗粒(VLPs)疫苗为主要研究形式。然而随着基因工程技术研究的不断发展,VLPs疫苗以其独有的天然优势已被广泛应用。其中乙肝病毒(HBV)VLPs疫苗和人乳头瘤病毒(HPV)VLPs疫苗的成功上市也为EV71 VLPs疫苗的研制提供了理论依据。尽管已有利用酵母系统(毕赤酵母、酿酒酵母系统),昆虫细胞(Sf9 cells)杆状病毒表达系统表达制备EV71 VLPs疫苗的研究报道,但均是以实验室方法(蔗糖密度梯度和Cs Cl密度梯度超速离心)纯化获得。而这种实验室纯化方法具有自身的局限性,因其生产工艺费时费力,成本昂贵,不利于疫苗的规模化研制及临床研究。为此,色谱层析纯化方法成为EV71 VLPs疫苗研制势在必行的关键因素。本论文针对以上的问题进行全面、具体、深入的研究。首先对EV71 VLPs疫苗表达条件进行优化,其次建立一种新型的多步色谱层析方法,最后对该方法制备的EV71 VLPs疫苗进行表征和有效性评价。以期获得符合药典相关要求的II EV71 VLPs基因工程疫苗,解决目前EV71 VLPs疫苗实验室方法研制纯化中存在的问题。本研究主要分为以下两个部分:第一部分:EV71 VLPs疫苗上游表达条件的优化和下游纯化方法的建立一、根据中国大陆手足口病流行性病学调查研究,我们选取EV71 C4流行株(EU703814.1),利用昆虫细胞杆状病毒表达系统制备EV71 VLPs,并对其进行细胞培养和重组病毒表达条件的优化,最终筛选出EV71 VLPs疫苗的最适表达条件。二、色谱层析纯化是制备高质量EV71 VLPs疫苗的重要手段。本研究通过新型流穿式的色谱层析柱(Capto TM Core700)、复合式强阴离子交换层析柱(Capto TM adhere)和弱疏水性层析柱(Capto TM butyl)的联合使用,建立一种新型的多步色谱层析方法,成功纯化了EV71 VLPs并进行检定,制备出针对手足口病的高纯度EV71 VLPs疫苗。第二部分:EV71 VLPs疫苗的表征和有效性的初步评价一、通过免疫荧光及原位免疫胶体金染色技术对EV71 VLPs进行细胞定位,结果显示本实验表达的EV71 VLPs主要存在于细胞质中。并对纯化终产物的纯度、宿主细胞杂质、形态、结构、直径、氨基酸序列、分子量、等电点、糖位点修饰等进行检测,结果表明本实验制备的疫苗符合药典的相关规定。二、利用Octet Red96 system(Forte Bio)蛋白质相互作用系统,对抗体与抗原的亲和性进行检测,发现其与22A12 m Ab有较高的亲和力,验证了EV71 VLPs疫苗具有良好的抗原性;通过动物免疫,利用本实验室建立的假病毒检测平台评价疫苗的中和抗体效价。结果发现与EV71灭活疫苗相比,EV71 VLPs疫苗具有较高的中和抗体滴度,证明了EV71 VLPs具有良好的免疫原性。三、体内保护力检测实验是评价该实验方法制备EV71 VLPs疫苗有效性的重要指标之一。我们通过TEM、HPLC、动物免疫、乳鼠体内免疫攻毒实验,验证了EV71 VLPs不仅具有良好的稳定性,同时还具有100%的体内免疫保护效果,可预防同源病毒的攻击。综上所述,通过摇瓶培养和WAVE生物反应器,我们优化了Sf9细胞的培养条件及EV71 VLPs疫苗的表达条件,为疫苗的下游纯化研究提供了强有力的依据。本研究成功的培养、纯化、表征手足口病基因工程疫苗,即昆虫细胞杆状病毒表达系统生产和多步色谱层析纯化方法制备的EV71 VLPs疫苗。该疫苗纯度可达95%以上,回收率为31.52%,具有良好的表征特性和稳定性,免疫后可产生约为215的中和抗体滴度,对同一亚型EV71致死剂量攻毒的乳鼠具有100%的体内保护率。因此,本实验建立的多步色谱层析方法是很有希望能够成为EV71VLPs疫苗规模化生产的理论依据,且该实验方法制备的EV71 VLPs疫苗也有希望成为一种有效的手足口病基因工程疫苗。本论文的创新点:在本研究中,我们首次建立了一种新型多步色谱纯化工艺,成功制备了纯度大于95%的EV71 VLPs疫苗。首次验证Sf9细胞对EV71 VLPs的翻译后修饰并确定了其具体的N-糖基化修饰位点,首次对多亚基EV71 VLPs疫苗进行一级结构分析。在细胞水平上对该疫苗的表达进行定位,对该疫苗的形态、结构、稳定性和抗原性等特征进行全面表征,在动物水平上评价了该疫苗的免疫原性,并利用已有的动物模型评价了该疫苗的免疫保护性。