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多倍化是植物进化的动力。多倍体通常分为异源多倍体和同源多倍体,同源多倍体基因组剂量增加通常会对基因的表达产生巨大的影响,从而影响到蛋白的表达,最终影响整个植株的性状。水稻是二倍体作物,通过人工染色体加倍可以获得同源四倍体水稻,与二倍体比较,四倍体水稻具有生长势强、籽粒大、茎粗、叶厚、叶片变长变宽、抗虫、抗病、抗旱能力强、生物量高等优势。通过研究四倍体水稻中种子大小相关基因的表达情况,分析倍性对基因表达的调控特点和规律,可以为分子育种提供依据。 本实验以4个水稻品种Balilla、93-11、南京11和海天及其四倍体为材料,分析了6个调控种子大小基因(GW2、GW5、HGW、qGW8、GS3和GS5)的表达情况,主要结果如下: 1、对四套二倍体-同源四倍体水稻进行田间观察和农艺性状调查,发现它们表型差异极显著,比如,四倍体的茎秆变粗、剑叶变宽变长、叶的颜色加深、植株变高、籽粒变大、结实率降低等。一般情况下,四倍体与二倍体的高度差大约在5cm左右,而93-11和其对应四倍体株高相差约16cm。 特别是在种子大小相关性状上,发现粒长(GL)、粒宽(GW)、长宽比(L/W)、籽粒表面积(GS)和籽粒周长(GC)这五个参数均存在极显著差异。同源四倍体的干粒重比二倍体增加31%~35%,籽粒长增加2~3cm、粒宽增加0.5cm左右等。 2、通过电镜扫描观察Balilla和DBalilla幼穗发育二次枝梗形成期和雌雄蕊形成期,结果发现二倍体水稻和四倍体水稻幼穗的发育进程基本一致,确保了取材的准确性。 3、通过Q-PCR技术分析6个主要控制种子大小基因在具有代表性的粳稻品种Balilla、籼稻品种93-11及其四倍体幼穗发育中的表达情况,结果发现:(1)在4n水稻中,与二倍体相比较,在同一幼穗发育时期,正调控基因表达上升,负调控基因表达下降,即分子水平的表达结果与种子大小表型一致。(2)部分基因的表达具有材料特异性。GW5在两对材料中均不表达,qGW8在Balilla中检测到发育早期沉默,而在93-11中则随发育时期表达上升。(3)多数基因的表达量随幼穗发育进程而变化,即具有表达时期特异性。在D93-11的幼穗发育初期,大多数基因的表达为上升趋势,到了第3、4期,表达为最高后,开始下降。而qGW8在整个发育时期,其表达水平一直呈上升趋势。(4)不同发育时期,不同的基因可能起主要调控作用。在幼穗发育1时期,负调控因子GW2、GS3在4n水稻D93-11中的表达下调较大,而正调节因子HGW、GS5和qGW8在4n水稻DBalilla中的表达远远高于2n水稻;在幼穗发育3时期,GS3在4n水稻D93-11中表达量最高,可能为主效基因;在幼穗发育5时期,qGW8在4n水稻D93-11中表达量最高,可能为主效基因。表明在不同的发育时期,可能由不同的基因发挥主要的调控作用。 4、通过转基因实验来验证基因过表达对种子大小的调控:在Balilla(2n)中过表达负调控基因GW2,然后获得28棵转基因植株。对这些转基因植株的标记(hyg)进行检测,可扩增出约800bp的目标片段,证明该基因已经转入植株中。对该基因进行Q-PCR表达差异检测,发现该基因的表达量变化为:Balilla(2n) T>Balilla(2n)>DBalilla(4n)(128.0>54.7>17.44)。而相应的植株的种子大小:Balilla(2n)T< Balilla(2n)<DBalilla(4n)(粒宽分别为2.95cm<3.61 cm<3.73cm,干粒重分别为22.3g<31.82g<49.41g)。该结果表明负调控基因GW2的表达变化与种子大小相一致。 综上所述,同源四倍体水稻种子大小相关基因的表达与倍性、发育时期及基因的功能有关,暗示我们可以通过控制种子大小基因(不同发育时期的主要调控基因)的表达,实现增大二倍体水稻种子的愿望,从而为我国水稻增产提供新的资源或者途径。