论文部分内容阅读
红曲霉是天然的色素和功能性食品添加剂的发酵菌株,在亚洲的许多国家应用广泛。红曲霉发酵产生的色素具有例如消炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化的有益功效,另外,红曲霉的其他次级代谢产物也具有多种机体调节功能。但是,随之产生的桔霉素会对人体肾脏、肝脏产生毒害作用,使其成为红曲霉产业的瓶颈,严重影响着产品的生产和出口。目前为止,红曲霉桔霉素产生及调控机制尚不清晰,本课题的研究为桔霉素产生机制提供一定的理论依据。本试验选取了三株在生长速度、产色素及桔霉素能力上明显不同的红曲霉菌种M2、FM46、FJ-1,利用7对引物扩增出三者的桔霉素合成基因簇,进行DNA测序,结果表明,三种红曲霉该基因簇序列相似性在99.9 %以上,与NCBI发布的序列几乎完全一致,证明该基因簇为红曲霉基因组的保守区域。通过实时荧光定量PCR比较分析三种红曲霉基因簇中相关基因表达水平,结合检索到的基因的生物学信息,确定ctnI、orf6、ctnR1为目标基因。试验通过根瘤农杆菌介导的遗传转化体系(ATMT)对红曲霉的桔霉素合成有关基因敲除进行尝试,并在ATMT体系基础上成功实现红曲霉orf6、ctnR1基因的敲除。试验首先对转化载体pAG1-H3进行了改造,获得了红曲霉ctnI、orf6、ctnR1基因敲除的载体以及orf6、ctnR1基因回复突变载体。ctnR1基因的同源重组概率可高达10.5%, orf6基因的同源重组概率为3 %。在基因功能鉴定方面,试验所获得的orf6、ctnR1突变株在营养生长速度略微减慢,orf6突变体色素合成稍微降低,ctnR1突变株色素的合成未受影响,但两者的产桔霉素能力明显升高,最高可比野生株高4.5倍,存在显著差异。根据这一结果预测,orf6、ctnR1基因为桔霉素合成途径中的调节因子,反馈抑制了桔霉素的合成,后续研究可通过基因过表达验证这一构想。