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研究目的观察参麻益智方通过调节血管性痴呆大鼠脑微血管内皮改善突触可塑性的作用机制。研究内容本研究以双侧颈总动脉永久结扎法建立血管性痴呆模型大鼠,采用参麻益智方干预三周后对各组大鼠进行Morris水迷宫实验,观察海马CA1区神经细胞病理形态、微血管密度,检测突触相关蛋白、VEGF/Flk-1/p38 MAPK信号通路相关蛋白,初步探索参麻益智方通过调节血管性痴呆大鼠脑微血管内皮改善突触可塑性的作用及机制。研究方法本研究采用双侧颈总动脉永久结扎法建立血管性痴呆大鼠模型。10周龄雄性Wistar大鼠100只,造模成功后随机分为7组:假手术组、模型组、阻断剂组、参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组、参麻益智方高剂量+阻断剂组、参麻益智方低剂量+阻断剂组,每组保证至少10只。阻断剂SU5416以25mg/kg进行腹腔注射,参麻益智方高剂量以16.5g/kg进行灌胃,参麻益智方低剂量以3.3g/kg进行灌胃,其余各组给予等量生理盐水灌胃以及等量PBS、DMSO腹腔注射,给药3周。通过Morris水迷宫实验评价各组别大鼠学习记忆能力。通过苏木精-伊红染色法观察各组大鼠海马CA1区病理形态。通过免疫组织化学染色法标记谷氨酸囊泡转运体、脑微血管内皮细胞,并进行微血管计数。Western-Blot检测NMDAR1、PSD-95、VEGF、Flk-1、p38 MAPK蛋白表达情况。实时荧光定量 PCR 检测 NMDAR1、PSD-95、VEGF、Flk-1、p38 MAPK mRNA 水平。研究结果1参麻益智方对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响定位航行试验中,各组的潜伏期总体上具有显著性差异（P<0.05）,且时间和分组的交互作用无显著性差异（P>0.05）;第3d、4d、5d,与假手术组相比,模型组潜伏期明显延长（P<0.05）。第3d与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组潜伏期明显缩短（P<0.05）。第4d与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组、潜伏期明显缩短（P<0.05）。第5d与模型组相比,参麻益智方高剂量组潜伏期明显缩短（P<0.05）。空间探索实验中,与假手术组相比,模型组穿台次数明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组穿台次数明显增多（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组穿台次数明显减少（P<0.05）。与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组穿台次数明显减少（P<0.05）。空间探索实验中,与假手术组相比,模型组在平台所在象限路程明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组在平台所在象限路程明显增多（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组穿台次数明显减少（P<0.05）。与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组穿台次数明显减少（P<0.05）。2参麻益智方对血管性痴呆大鼠海马CA1区病理形态的影响显微镜下观察各组大鼠海马切片CA1区锥体细胞的病理形态,可见神经细胞核呈现浅蓝色,细胞质呈现粉红色。假手术组锥体细胞排列紧密坚实,细胞核饱满清晰,整齐有序,有明显分界。与假手术组相比较,模型组锥体细胞排列疏松,可见锥体细胞层的脱落变薄,残存锥体细胞胞核缩小,轴突散乱断裂,分界不清晰。与模型组相比,阻断剂组锥体细胞排列疏松,轴突散乱断裂。与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组锥体细胞层总体上均排列规律整齐、轴突断裂较少。3参麻益智方对脑微血管内皮细胞的影响CD31免疫组织化学法染色:脑微血管内皮细胞成棕黄色,假手术组脑微血管内皮细胞结构完整、形态规则呈扁平状,大小适中。模型组脑微血管内皮细胞可见染色加深,血管畸形开放,边缘轮廓不规则,直径大小不一,分布密集。与模型组相比,阻断剂组脑微血管内皮细胞数量减少。与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组脑微血管内皮细胞轮廓较为规则,血管闭合,边缘轮廓清晰,直径大小接近。微血管密度计数方面:与假手术组相比,模型组微血管密度计数明显增多（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组微血管密度计数明显减少（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组微血管密度计数明显减少（P<0.05）;与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组微血管密度计数明显减少（P<0.05）。4参麻益智方对突触相关蛋白的影响谷氨酸囊泡转运体免疫组织化学法染色:与假手术组相比,模型组谷氨酸囊泡转运体阳性表达明显减少。与模型组相比,阻断剂组、参麻益智高剂量+阻断剂组、参麻益智低剂量+阻断剂组VGLUT 阳性表达明显减少,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组VGLUT 阳性表达明显增多。N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1方面:与假手术组相比,模型组N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1蛋白和mRNA表达含量明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1蛋白和mRNA表达含量明显升高（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1蛋白和mRNA表达含量明显降低（P<0.05）,与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1蛋白和mRNA表达含量明显降低（P<0.05）。突触后致密物蛋白-95方面:与假手术组相比,模型组突触后致密物蛋白-95蛋白和mRNA表达含量明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组突触后致密物蛋白-95蛋白表达明显升高（P<0.01）、mRNA含量明显升高（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组突触后致密物蛋白-95蛋白表达含量明显降低（P<0.01）、mRNA含量明显降低（P<0.05）。与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组突触后致密物蛋白-95蛋白含量明显降低（P<0.01）、mRNA含量明显降低（P<0.05）。5参麻益智方对血管性痴呆大鼠海马组织VEGF、FLK-1、P38 MAPK表达的影响VEGF方面:与假手术组相比,模型组VEGF蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组VEGF蛋白表达和mRNA含量明显升高（P<0.05）,参麻益智方低剂量组VEGF蛋白表达明显升高（P<0.01）、mRNA含量明显升高（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组VEGF蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）。与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组VEGF蛋白表达明显降低（P<0.01）、mRNA含量明显降低（P<0.05）。FLK-1方面:与假手术组相比,模型组FLK-1蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）。与模型组相比,参麻益智方高剂量组FLK-1蛋白和mRNA含量明显升高（P<0.05）,参麻益智方低剂量组FLK-1蛋白表达明显升高（P<0.01）、mRNA含量明显升高（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组FLK-1蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）。与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组FLK-1蛋白表达明显降低（P<0.01）、mRNA含量明显降低（P<0.05）。P38 MAPK方面:与假手术组相比,模型组p38 MAPK蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）;与模型组相比,参麻益智方高剂量组、参麻益智方低剂量组p38 MAPK蛋白和mRNA含量明显升高（P<0.05）。与参麻益智方高剂量组相比,参麻益智高剂量+阻断剂组p38 MAPK蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）,与参麻益智方低剂量组相比,参麻益智低剂量+阻断剂组p38 MAPK蛋白和mRNA含量明显降低（P<0.05）。实验结论参麻益智方可以改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆能力,保护海马CA1区锥体细胞。同时改善脑微血管内皮细胞形态和功能,促进突触相关蛋白囊泡型谷氨酸转运体表达、促进N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白1及mRNA表达,促进突触后致密物95蛋白及mRNA表达,促进VEGF/FLK-1/P38 MAPK信号通路相关蛋白及mRNA表达。本研究初步表明参麻益智方可以通过改善脑微血管内皮细胞的功能,激活VEGF/FLK-1/P38 MAPK信号通路,改善神经细胞突触可塑性,从而对VaD模型大鼠的学习记忆功能起到保护作用。参麻益智方的调控作用揭示了血管性痴呆新的治疗策略,为进一步研究神经元突触与脑微血管内皮细胞的相互作用奠定机制基础。同时印证了“血脉和利,精神乃居”的中医理论内涵,开辟了从络脉调治五神的新思路。