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研究背景:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种来源于B细胞系的恶性血液系统疾病,蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Bort)的应用明显改善了 MM患者预后,患者中位生存期由原来的3～5年延长到5～7年,但MM细胞原发及继发性耐药导致患者难治、复发甚至死亡,是Bort治疗MM失败的一个主要原因。目前MM耐药分为两种类型。MM细胞本身的不稳定性导致某些功能蛋白的表达和结构变化以及MM骨髓微环境介导的药物耐药。我们的前期研究发现MM患者骨髓微环境中的巨噬细胞(MΦs)不仅能够促进MM细胞的生长、增殖和血管形成,还可以保护MM细胞免受化疗药物诱导的凋亡。进一步研究表明MΦs介导的MM细胞耐药依赖于细胞间的相互接触,提示MΦs和MM细胞之间的表面分子的相互作用可能在其中发挥重要作用。B细胞激活因子(BAFF)主要由外周血单个核细胞表达和分泌,包括中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等。已经有文献报道BAFF可以促进MM细胞的增殖并且保护MM细胞免受地塞米松诱导的凋亡。我们的前期研究发现MΦs和MM细胞均表达BAFF及其受体。因此,本实验在前期研究的基础上进一步阐述BAFF在MΦs与MM细胞相互关系中的作用是否与Bort耐药相关,探讨BAFF发挥作用的具体分子机制。研究目的:1.体外诱导MΦs及鉴定,明确MΦs在MM中的作用。2.体外实验及动物实验中探讨BAFF在MΦs与MM相互关系中的作用,揭示BAFF在MM中的角色,并研究其具体机制。研究方法:1.qRT-PCR、Flowcytometry 检测 MM 细胞中 BAFF 及其三个受体 BAFF-R、TACI、BCMA的表达,Immunofluorescence检测MM患者骨髓MΦs中BAFF的表达。2.倒置相差显微镜观察形态学和Flowcytometry测定表面分子CD68、CD163来鉴定MΦs,Flowcytometry 检测 MΦs 中 BAFF 及其三个受体 BAFF-R、TACI、BCMA的表达。3.ELISA检测MM患者骨髓上清、MM细胞株上清、MΦs上清中BAFF的分泌。4.CCK-8、Flowcytometry 分别检测 rhBAFF、MΦs 对 MM 细胞增殖及在 Bort 作用下凋亡情况的影响,Western blot进一步检测凋亡相关蛋白的变化。5.MΦs和MM共培养体系中加入BAFF的中和性抗体,小干扰RNA敲低MΦs中BAFF的表达,Flowcytometry检测MM细胞的凋亡率,Western blot检测MM细胞凋亡蛋白,AKT、ERK、SRC、NFKB信号通路,以及pH2A.X的变化。6.皮下注射ARP-1、ARP-1/PBMC构建MM-NΦD-SCID移植瘤小鼠模型,在体内验证BAFF在MΦs诱导多发性骨髓瘤细胞Bort耐药中的作用。研究结果1.MM细胞中BAFF及BAFF受体的表达。qRT-PCR结果显示原代MM细胞中BAFF差异表达,其受体BCMA的表达高于TACI,BAFF-R低表达。MM细胞株MM.1S、MM.1R、CAG、RPMI8226、ARP-1 和ARK也有BAFF的差异表达,BCMA和TACI相对高表达,BAFF-R低表达。Flowcytometry结果显示RPMI8226、ARP-1表面BAFF、BCMA、TACI和BAFF-R的表达情况与qRT-PCR结果一致。2.MΦs的鉴定及MΦs中BAFF及BAFF受体的表达。倒置相差显微镜观察到PBMC诱导的巨噬细胞为长梭形、贴壁生长。Flowcytometry结果显示MΦs表面有CD68、CD163的表达,且CD163表达较高,提示PBMC诱导的MΦs偏M2型。同时,我们发现MΦs诱导过程中BAFF的表达逐渐增加,且MΦs中BAFF-R、TACI、BCMA相对低表达。免疫荧光结果显示MM患者骨髓中MΦs有BAFF的表达。3.MM患者骨髓、MM细胞株和MΦs上清中BAFF的分泌。ELISA测得MM患者骨髓上清中分泌的BAFF较高,MΦs上清中BAFF的分泌高于MM细胞株中BAFF的分泌。4.rhBAFF对MM细胞增殖和存活的影响。rhBAFF可以促进ARP-1和RPMI8226的增殖,在200ng/mL浓度下促增殖作用最明显。MM细胞给予Bort处理时,rhBAFF可降低ARP-1和RPMI8226对Bort的敏感性,分别在200ng/mL和400ng/mL时ARP-1和RPMI8226对Bort的敏感性有明显下降。5.MΦs对Bort不敏感且可以保护MM细胞耐受Bort诱导的凋亡。CCK8法测得ARP-1、RPMI8226对Bort的IC50分别是5nM、10nM。流式检测发现低中浓度的Bort(0-80nM)仅引起MΦs发生少量凋亡。Bort分别处理单独MM细胞株、与MΦs共培养的MM细胞株24h后,与MΦs共培养组Bort诱导细胞凋亡减少。单独MM细胞株组和与MΦs共培养的MM细胞株组凋亡细胞的比例分别为:ARP-1,50.8 ± 2.40%vs 19.58 ± 2.31%(p=0.0007);RPMI8226,53.3 ±1.89%vs 28.74 ±2.04%(p=0.0004)。单独原代MM细胞、与MΦs共培养的原代MM细胞体外培养5h后,与MΦs共培养组自发凋亡的细胞明显减少。单独原代MM细胞组和与MΦs共培养的原代MM细胞组凋亡细胞比例分别为:55 ±3.20%vs 14.85 ± 2.79%(p=0.0003)。6.BAFF在MΦs介导的MM细胞Bort耐药中发挥了作用。BAFF中和性抗体减弱了MΦs对MM细胞的保护作用。Annexin V凋亡分析显示在给予Bort处理时MM细胞与MΦs共培养体系中加入BAFF的中和性抗体组和加入同型对照IgG2B组凋亡率分别为:ARP-1,35.4± 1.07%vs20.04± 1.98%(p<0.05);RPMI8226,62.5± 2.89%vs 19.75 ± 2.34%(p<0.05)。原代MM细胞与MΦs共培养体系中加入BAFF的中和性抗体组和加入同型对照IgG2B组凋亡率分别为:35.95 ± 3.07%vs 21.07±1.98%(p<0.05)。同时,BAFF敲低的MΦs对MM细胞的保护作用减弱,并且MΦs中BAFF的敲低程度与其保护作用负相关。AnnexinV凋亡分析显示在给予Bort处理时,MΦs-siCtl和MΦs-siBAFF分别与MM细胞株共培养时凋亡率分别为:ARP-1,20.34 ± 1.07%vs 54.2 ± 1.98%(p<0.01);RPMI8226,23.4 ± 2.89%vs 53.4 ± 2.34%(p<0.01)。7.BAFF影响MΦs-MM细胞信号蛋白的变化。Western blot结果显示MΦs明显减少了Bort诱导的MM细胞凋亡蛋白caspase3、PARP剪切体的表达。而在给予Bort处理MΦs-MM中加入BAFF的中和性抗体或者敲低MΦs中的BAFF的表达,caspase3、PARP剪切体的表达出现增加。进一步机制研究发现,MΦs可以激活MM细胞磷酸化的AKT、ERK、SRC、H2A.X以及NF-κB信号通路,而在给予Bort处理MΦs-MM中加入BAFF的中和性抗体或者敲低MΦs中的BAFF的表达后,明显减弱了pAKT、pERK、pSRC、pH2A.X的激活状态,NF-κB的经典和非经典通路都收到了抑制。8.动物实验中观察BAFF在MΦs介导的MM细胞Bort耐药中的作用。在皮下注射ARP-1、ARP-1/PBMC细胞建立MM移植瘤小鼠模型,成瘤后收取瘤体组织后免疫组化结果显示ARP-1/PBMC组CD68表达明显高于单独ARP-1组,说明ARP-1/PBMC组巨噬细胞浸润程度高于单独ARP-1组。给予Bort连续处理2周后,收取瘤体组织后免疫组化结果示单独ARP-1组c-PARP表达明显高于ARP-1/MΦ组,流式细胞术结果显示单独ARP-1组和ARP-1/MΦ组细胞凋亡率分别为:62.2 ± 1.07%vs 37.6 ± 1.98%(p=0.0097)。瘤体体积结果显示ARP-1/MΦ Bort组的肿瘤负荷较ARP-1 Bort组肿瘤负荷大,两组之间存在统计学差异(p<0.05),同时,ARP-1/MΦ(Bort组)肿瘤负荷较ARP-1/MΦ(Bort+BAFF的中和性抗体组)组肿瘤负荷大,两组之间存在统计学差异(p<0.05)。结论:1.MM细胞中主要表达BCMA和TACI,MΦs主要表达BAFF,MM骨髓上清中有BAFF的分泌。2.外源性的BAFF可以促进MM细胞株的增殖和存活。3.MΦs对Bort不敏感且可以保护MM细胞免受Bort引起的凋亡。4.MΦs与MM细胞的共培养体系中加入BAFF的中和性抗体,或者敲低MΦs中BAFF的表达,MΦs对MM细胞的保护作用减弱。5.BAFF介导的MΦs对MM细胞的保护作用,抑制了凋亡蛋白和DNA损伤效应蛋白的表达,激活了AKT、ERK、SRC、NF-κB信号通路。6.MΦs可以减少MM移植瘤小鼠对Bort的敏感性,BAFF的中和性抗体可以恢复MM移植瘤小鼠对Bort的敏感性。