双组份信号转导系统（Two-component signal transduction system,TCS）在真核生物中也广泛分布,其在细胞的抗逆响应,尤其是在对渗透压、氧化、盐和低温等胁迫的耐受上都扮演了极为重要的角色。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFA）与微生物低温生长适应性有关,且细菌中已经证实双组份信号转导系统能调节PUFA低温合成并促进菌株的低温生长适应性,但真菌中仍未见类似报道。我们前期的研究结果显示,具有低温生长适应性的产油红酵母—红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235菌株中过表达组氨酸激酶基因HisK2301可明显提高YM25235菌株对盐和渗透压胁迫的适应性,还能促进YM25235菌株低温条件下甘油以及亚油酸（linoleic acid,LA）和α-亚麻酸（α-linolenic acid,ALA）两种PUFAs的合成增加,提高了YM25235菌株的低温生长适应性,说明组氨酸激酶HisK2301可能与YM25235菌株的低温生长适应性和低温条件下菌株中PUFA的合成调节有关,但具体的功能还待于进一步分析验证。本研究利用同源重组方法对YM25235菌株中HisK2301基因进行敲除,经过胁迫抗性筛选和基因组DNA的PCR验证成功获得了HisK2301基因敲除突变株YM25235HisK2301Δ。功能分析结果显示,HisK2301基因敲除显著降低了YM25235菌株对盐、渗透压和氧化胁迫的耐受性以及低温生长适应性,同时引起低温条件下菌株中甘油和PUFA合成显著下降,LA和ALA两种PUFAs分别从对照菌株中的31.85%和9.56%降到25.51%和5.67%。进一步通过基因回补实验将HisK2301基因转化回YM25235HisK2301Δ菌株中表达,显著恢复了突变菌株对上述胁迫的耐受性,低温条件下甘油和PUFA合成水平也明显恢复。这些结果进一步证明,HisK2301基因与YM25235菌株的盐胁迫、渗透压胁迫和氧化胁迫的耐受性有关,还与低温条件下YM25235菌株中甘油和PUFA合成调节有关,进而提高了菌株的低温生长适应性,通过低温条件下甘油合成基因RKGPD1和PUFA合成相关基因RKD12的转录水平变化也证明这一点。此外,HisK2301基因敲除还导致低温条件下RKHog1基因和RKMsn4基因的m RNA转录水平也显著下调。结合我们前期的基于RKHog1和RKMsn4两个基因的分析结果,可以推断:YM25235菌株中基于组氨酸激酶HisK2301介导的低温信号传递以及PUFA和甘油低温合成调节可能与HOG-MAPK信号途径和锌指转录因子RKMsn4也有关,但具体相互作用还有待于进一步研究。很多研究表明,类胡萝卜素（Carotenoids）种类和含量与微生物对低温、氧化和强光等多种环境胁迫的适应性有关,我们前期分析也显示低温条件下YM25235菌落颜色更红。因此,本研究进一步分析了低温条件下HisK2301基因敲除对红冬孢酵母YM25235类胡萝卜素合成的影响。分析结果显示,低温条件下YM25235菌株中氧化胁迫提高,导致类胡萝卜素含量显著提高,从2.03 mg/g DCW增加到3.54 mg/g DCW,而在基因敲除突变株YM25235HisK2301Δ中提高不显著,但基因回补菌株中也显著提高。此外,分析结果还显示,低温条件下四种类胡萝卜素组分中β-胡萝卜素增加尤为明显。这些结果表明,类胡萝卜素组成和含量可能也与YM25235菌株的低温生长适应性有关,而且组氨酸激酶HisK2301与YM25235菌株中类胡萝卜素低温合成调节有关,同样类胡萝卜素合成相关基因的转录水平变化也证明这一点。总之,本研究通过基因敲除及基因回补方法证明组氨酸激酶HisK2301不仅与红冬孢酵母YM25235菌株在盐、渗透压和氧化胁迫环境下的耐受性有关,还与低温条件下YM25235菌株中甘油、PUFA和类胡萝卜素的合成调节有关,影响菌株的低温生长适应性,而且基于组氨酸激酶HisK2301介导的低温信号传递并引起甘油、PUFA和类胡萝卜素的低温合成调节还与HOG-MAPK信号途径和锌指转录因子RKMsn4有关。本研究结果有助于完全阐明红冬孢酵母YM25235菌株中HisK2301介导的甘油、PUFA和类胡萝卜素低温合成的信号转导途径及其潜在的调节机制,为进一步完全揭示YM25235菌株低温适应性机制以及相关的理论和应用研究打下基础。