前言 细胞凋亡是细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，主动结束生命的一种死亡形式。细胞凋亡在正常胚胎和器官发育、免疫反应、维持细胞数量恒定、清除无功能或异常细胞以及多种遗传性和获得性疾病的发生和发展过程中都具有举足轻重的作用。随着对细胞凋亡研究的深入，人们逐渐认识到细胞凋亡还可调控细胞增殖以及肿瘤的发生与进展，其紊乱可导致细胞数量异常和加速肿瘤的发生和恶化。所以近年来，凋亡在肿瘤的发生、发展及防治中的作用越来越受到人们的重视。由于肿瘤细胞对药物诱导的凋亡作用较正常细胞敏感，所以应用药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为临床肿瘤化疗的重要手段。 在细胞凋亡众多的信号分子中，钙离子的作用受到普遍关注。细胞内Ca²⁺浓度升高可激活内源性核酸内切酶、一切相关的蛋白酶、蛋白激酶C（PKC）、并参与拓扑酶Ⅱ活化等，引起细胞凋亡。另有许多实验发现细胞凋亡时，细胞内钙离子浓度降低。总之细胞内钙离子浓度失衡是引起细胞凋亡的重要因素。许多能改变钙浓度的药物如和钙螯合剂EGTA、EDTA等都可诱导细胞凋亡。 克霉唑（CLT）是咪唑类抗真菌药物，长期以来在临床上用于抗真菌治疗。但最近有研究表明克霉唑对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用。其作用机制是通过持续耗竭细胞内钙库，在翻译起始水平抑制一些生长促进蛋白的合成，从而抑制细胞增生。钙库的耗竭将导致胞浆内[Ca²⁺]的升高，而这恰恰是启动细胞凋亡的信号途径之一。所以在这些研究基础上，我们用克霉唑处理体外培养的人结肠癌细胞CCL229，首次研究了克霉唑在体外诱导人结 肠癌CCM29细胞凋亡的作用，为CLT作为抗肿瘤药应用于临床 提供了进一步的理论依据。 实验材料与方法 本实验应用培养的高侵袭性人结肠癌CCL229细胞，检测克 霉哩诱导CCIn29细胞凋亡的作用。收集处于对数生长期的细 胞，以 10＊Inl浓度接种细胞，培养24小时待细胞贴壁后给药。 CLT以无水乙醇配成0．lin。UL贮存液，4t保存，使用终浓度分别 为25 pmoVL，30卜moUL，35卜moUL。对照组加人等体积无水乙醇 以 0．1％，V／V人此浓度下乙醇对细胞生长无明显影响。实验组 每隔48小时换新鲜培养液及CLT。药物处理不同时间后收集实 验组及对照组细胞。利用荧光显微镜、电子显微镜观察细胞的形 态变化，流式细胞仪检测细胞周期变化及亚二倍体比例，并利用 DNA琼脂糖凝胶电泳及TUNEL法进行凋亡的分子生物学检测。 实验结 果 浓度分别为 25 pmol／L，30 pmol／L，35 pmoVL的 CLT作用于体 外培养的人结肠癌细胞CCIn29。对照组加入等体积无水乙醇 以．l％，V／V人荧光显微镜下见 AO染色的对照组 CCM29细 胞核呈黄绿色荧光，染色均匀一致。经 30卜moUL CLT作用后可 见胞核固缩，染色质高度浓缩凝聚，分块成亮黄色荧光。凋亡严重 时，细胞出泡形成凋亡小体。透射电镜下，CCDe29细胞经 30pmoVL CLT处理24 ／J’时后，核内染色质边集，沿核膜内侧分 布，核膜皱把内陷。至48小时，核染色质更加致密，浓缩分块，或 呈新月型聚集于核膜下，胞质中有空泡形成。至72小时，可见凋’亡细胞表面出泡，最终脱落形成膜包裹的凋亡小体。扫描电镜下， ·2·30 tLCLT诱导后CCto29细胞收缩变圆，微绒毛显著减少，伪足消失，细胞表面突起出泡，逐渐与正在凋亡的细胞分离，最终将脱落形成多个大小不等的凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带，即细胞凋亡典型的“DNA ladder”。TUNEL法是检测早期细胞凋亡的较敏感手段。经30wlOVL CLT处理后，用TI］NEL法检测可见凋亡阳性细胞，细胞核呈棕色或棕褐色着染。晚期凋亡细胞变圆，体积明显缩小。另外可见到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞。随时间推移，凋亡指数逐渐增加，至72小时达高峰(47％人流式细胞术分析不同浓度CLT对CCI229细胞凋亡的诱导作用的结果显示 25－35 p＊of／L CLT处理细胞 24 ／J’时后，在DNA组方图上均出现低于Q期二倍体含量的亚二倍体峰(hroo－dghoid peak，亚 GI峰人随药物浓度增加，亚0峰逐渐升高。亚二倍体细胞百分比也逐渐增加，从25卜moUL时的8．42％增加到35卜mo＊L时的38．＊啪。从引〕卜OO＊L＊u作用不同时间后的DNA组方图上可以看出，对照组呈现典型的二倍体峰，实验组处理12小时后出现亚Q峰，随时间推移，亚GI峰逐渐升高，亚二倍体细胞百分比也逐渐升高，12 ／J’时为9．68％，24 ／J＼时和48 4、时分别为历．62％和 39．90锯，至 72小时则增至 47．6％。这些结果提示人LT对CCL229细胞的凋亡诱导作用具有明显的时间和剂量依赖性。与亚GI峰逐渐升高相对应人 期细胞比例分别由12小时的 50．08％下降至 35．66（y（24小时），19．99％（48小时）和16．sl％门2小时），前者升高的幅度与后者下降的幅度基本一致。由此可以推测CLT选择性地诱导m期细胞凋亡。 ?