【摘 要】
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该研究做了二方面的工作：一方面利用Tn5gusA5随机诱变方法,对慢生型大豆根瘤菌22-10的染色体进行了插入诱变,筛选到抗春雷霉素（ksg）突变体6株.根据已知的Tn5gusA5序列,设计引物,
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该研究做了二方面的工作：一方面利用Tn5gusA5随机诱变方法,对慢生型大豆根瘤菌22-10的染色体进行了插入诱变,筛选到抗春雷霉素（ksg）突变体6株.根据已知的Tn5gusA5序列,设计引物,经PCR检测,结果表明突变体染色体DNA上并无Tn5gusA5的插入,推测抗春雷霉素突变株为自发突变.另一方面,从NCBI Genebank Blast中查到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobium loti）的春雷霉素敏感基因（ksgA）序列,经alignment（对齐）分析,选择高度保守区,设计引物.以慢生型大豆根瘤（B.japonicum）22-10的总DNA为模板,扩增出长度为520bp的DNA片段.通过NCBI Gene Bank Blast分析,表明它与已发表的Agrobacterium、Mesorhizobium和Sinorhizobium的ksgA基因具有相当高的一致性,说明扩增的520bp产物是慢生型大豆根瘤菌22-10的ksgA基因的部分片段.然后利用Tail-PCR方法扩增出520bp片段的两侧,获得一长度为1598bp的DNA片段,其内含一个完整的ORF（开放阅读框架）,该ORF长度为858bp,命名为B.jksgA.Blastx分析结果表明其氨基酸一级结构与已报道的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的ksgA基因的氨基酸同源性高达69﹪.初步认为已扩增的858bp的ORF是慢生型大豆根瘤菌22-10的ksgA基因.根据已知的含有B.jksgA基因的1598bp DNA序列,设计引物PCR扩增B.jksgA基因的ORF的两侧序列,左侧为395bp,右侧为345bp.同时从质粒载体上PCR扩增Km基因的ORF.将左侧395bp、Km基因的ORF、右侧345bp混合后,加入左侧片段的正向引物和右侧片段的反向引物进行PCR连接,获得B.jksgA基因缺失结构体（LksgA）.将LksgA结构体连接到pIJ3200上,得到重组质粒pIJ32LksgA,电脉冲转化法转化B.japonicum 22-10,以进行同源双交换,利用pIJ3200（pLAFR系列）与pPH1JI质粒的不相容性,赶走pIJ32LksgA质粒,选择Rif抗体、Km抗性及春雷霉素抗性（ksg）,获得B.jksgA基因置换突主体4株,PCR验证结果表明4株突变体的ksgA基因已被LksgA结构体定点置换.从而地一步证实了我们扩增到的B.jksgA基因是慢生型大豆根瘤菌22-10的春雷霉素敏感基因（ksgA）.
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