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目的:长链非编码RNA(Lnc RNA)在多种病理与生理过程中发挥重要作用,Lnc RNA-mi RNA-m RNA调控网络在胃癌发生及发展过程中扮演重要角色。长链非编码RNA核仁小分子RNA宿主基因1(Lnc RNA SNHG1)在肿瘤发生及侵袭过程中发挥促癌基因作用,本研究以Lnc RNA SNHG1为焦点深入探讨Lnc RNA SNHG1在胃癌发展中的作用机制,通过鉴定其调控基因发现Lnc RNA SNHG1可能靶向调控mi R-101-3p表达,进一步预测mi R-101-3p的靶基因可能为SEC24A,本研究拟初步探究Lnc RNA SNHG1、mi R-101-3p、SEC24A在胃癌中的表达、生物学功能及其分子机制,为胃癌诊断及治疗提供新靶点。方法:1、选取2012年5月~2013年3月本院收治的60例胃癌患者为研究对象,并收集胃癌患者临床病理资料,采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)法检测Lnc RNA SNHG1在胃癌组织中的表达水平。根据检测结果将胃癌患者分为Lnc RNA SNHG1高表达组(33例)与低表达组(27例),分析其表达与胃癌患者临床病理特征的关系。胃癌患者术后均接受5年随访并统计患者总生存率及生存时间,采用Kaplan-Meier法对胃癌患者5年生存情况进行分析。2、体外培养胃癌细胞株MGC-803、AGS、HGC-27、SGC-7901与正常粘膜上皮细胞GES-1,采用q RT-PCR法检测胃癌细胞与正常粘膜上皮细胞中Lnc RNA SNHG1、mi R-101-3p、SEC24A m RNA的表达水平,采用瞬时转染技术将si-SNHG1、si-NC分别转染入MGC-803细胞、AGS细胞,q RT-PCR法检测验证转染效率。Transwell细胞迁移及侵袭实验分析沉默SNHG1表达后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响;流式细胞术检测沉默SNHG1表达后对胃癌细胞凋亡的影响;检测沉默SNHG1表达后胃癌细胞糖酵解水平。3、通过生物信息学方法筛选SNHG1下游mi RNA,预测显示mi R-101-3p可能是SNHG1下游的mi RNA,q RT-PCR法检测胃癌细胞与正常粘膜上皮细胞中mi R-101-3p的表达水平,采用双荧光素酶报告基因实验验证SNHG1与mi R-101-3p的相互作用,RNA免疫共沉淀技术进一步验证SNHG1与mi R-101-3p的结合作用,q RT-PCR法检测SNHG1与mi R-101-3p表达的调控关系。4、通过靶基因预测mi R-101-3p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验与RNA免疫共沉淀验证mi R-101-3p与SEC24A的靶向调控关系,蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测胃癌MGC-803细胞、AGS细胞中过表达mi R-101-3p或抑制mi R-101-3p表达后靶基因SEC24A的表达变化。采用Pearson法分析Lnc RNA SNHG1、mi R-101-3p与SEC24A的表达关系。5、双荧光素酶报告基因实验验证Lnc RNA SNHG1、mi R-101-3p与SEC24A的调控作用,将mi R-101-3p mimic、pc DNA-SNHG1与野生型质粒SEC24A-WT分别转染入MGC-803细胞、AGS细胞,检测转染后SEC24A-WT报告基因载体的荧光素酶活性。分别将pc DNA、pc DNA-SNHG1、si-NC、si-SNHG1转染入胃癌细胞,共转染分组为si-SNHG1+anti-mi R-NC组(si-SNHG1与anti-mi R-NC共转染胃癌细胞)、si-SNHG1+anti+mi R组(si-SNHG1与anti-mi R-101-3p共转染胃癌细胞),采用Western blot法检测转染后胃癌细胞中SEC24A的蛋白表达水平。6、为验证mi R-101-3p与SEC24A对Lnc RNA SNHG1的调控作用,分别将pc DNA、pc DNA-SEC24A、anti-mi R-NC、anti-mi R-101-3p与si-SNHG1共转染MGC-803细胞、AGS细胞,采用q RT-PCR法检测转染后MGC-803细胞、AGS细胞中mi R-101-3p的表达变化,Western blot法检测转染后MGC-803细胞、AGS细胞中SEC24A的表达变化。7、探究Lnc RNA SNHG1-mi R-101-3p-SEC24A轴在胃癌细胞生物学功能中的作用,将MGC-803与AGS细胞随机分为:si-SNHG1+anti-mi R-NC组(si-SNHG1与anti-mi R-NC共转染至MGC-80细胞、AGS细胞)、si-SNHG1+anti-mi R组(si-SNHG1与anti-mi R-101-3p共转染至MGC-80细胞、AGS细胞)、si-SNHG1+pc DNA组(si-SNHG1与pc DNA共转染至MGC-80细胞、AGS细胞)、si-SNHG1+SEC24A组(si-SNHG1与pc DNA-SEC24A共转染至MGC-80细胞、AGS细胞)。Transwell细胞迁移及侵袭实验分析共转染后胃癌细胞迁移、侵袭能力;流式细胞术检测共转染后胃癌细胞凋亡水平;检测共转染后胃癌细胞糖酵解水平。8、构建sh-SNHG1稳定表达的细胞系,将SNHG1 sh RNA干扰质粒、阴性对照质粒(sh-NC)与空质粒分别转染至胃癌MGC-80细胞,分别为Empty组(转染空质粒)、sh-NC组(转染sh-NC)、sh-SNHG1组(转染SNHG1 sh RNA干扰质粒),将转染后的MGC-803细胞经皮下注射入小鼠,正常饲养4周后处死小鼠并检测小鼠移植瘤体积及肿瘤重量。采用q RT-PCR法检测各组小鼠移植瘤中mi R-101-3p的表达水平,Western blot法检测各组小鼠移植瘤中SEC24A的表达水平。结果:1、SNHG1在SNHG1在胃癌组织中的平均表达量显著高于正常胃组织(P<0.01),以SNHG1相对表达量的平均值将60例胃癌患者分为SNHG1高表达组与低表达组,SNHG1高表达与胃癌患者TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移呈正相关(P<0.01),与胃癌患者年龄与性别无显著相关性(P>0.05)。SNHG1高表达组胃癌患者总生存率明显低于低表达组(P<0.01)。2、不同胃癌细胞株MGC-803、AGS、HGC-27、SGC-7901中Lnc RNA SNHG1的表达水平较正常粘膜上皮细胞GES-1明显升高(P<0.01),MGC-803、AGS细胞中Lnc RNA SNHG1的表达量较HGC-27、SGC-7901细胞明显升高,因此本研究选取MGC-803、AGS细胞进行后续实验研究。q RT-PCR检测结果显示MGC-803细胞、AGS细胞中转染Lnc RNA SNHG1 si RNA后SNHG1的表达水平明显降低(P<0.01),转染si-SNHG1后MGC-803细胞与AGS细胞迁移数均显著少于si-NC组(P<0.01),细胞侵袭数较si-NC组显著减少(P<0.01),而细胞凋亡率明显增加,促进caspase-3表达。与si-NC组比较,si-SNHG1组胃癌MGC-803细胞、AGS细胞葡萄糖的消耗水平均明显降低(P<0.001),乳酸水平明显降低(P<0.001)。Western blot检测MGC-803细胞、AGS细胞中己糖激酶-2(hexokinase-2,HK2)的蛋白表达水平,结果显示si-SNHG1组胃癌MGC-803细胞、AGS细胞中HK2蛋白表达水平较si-NC组明显降低(P<0.001)。3、双荧光素酶报告基因实验结果显示SNHG1可直接吸附mi R-101-3p序列位点,并可调控其表达活性,RNA免疫共沉淀实验结果显示SNHG1可直接吸附mi R-101-3p而发挥作用。与GES-1细胞比较,MGC-803、AGS、HGC-27、SGC-7901细胞中mi R-101-3p表达水平均显著降低(P<0.01),GC-803、AGS细胞中mi R-101-3p表达水平相对较低,SNHG1过表达后MGC-803细胞与AGS细胞中mi R-101-3p的表达水平显著降低(P<0.01),而沉默SNHG1表达后mi R-101-3p的表达水平显著升高(P<0.01)。4、双荧光素酶报告基因实验与RNA免疫共沉淀实验结果显示SEC24A是mi R-101-3p的靶基因,mi R-101-3p可通过吸附SEC24A的3’UTR区域结合位点而抑制SEC24A表达,SEC24A在胃癌细胞中的表达水平明显升高(P<0.01)。相关性分析显示SEC24A与mi R-101-3p呈负相关(P<0.01),而Lnc RNA SNHG1与SEC24A呈正相关(P<0.01)。进一步研究发现SNHG1与mi R-101-3p可共同调控SEC24A的表达,抑制mi R-101-3p与SEC24A过表达又可逆转si-SNHG1对mi R-101-3p和SEC24A表达的调控。5、与si-SNHG1+anti-mi R-NC组比较,si-SNHG1+anti-mi R组MGC-803细胞、AGS细胞迁移数明显增加(P<0.01),细胞侵袭数明显增加(P<0.01),葡萄糖消耗与乳酸生成水平及HK2蛋白表达均明显升高(P<0.01),细胞凋亡率均显著降低(P<0.01),显著抑制caspase-3的表达(P<0.01);与si-SNHG1+pc DNA组比较,si-SNHG1+SEC24A组MGC-803细胞、AGS细胞迁移数较明显增加(P<0.01),细胞侵袭数明显增加(P<0.01),葡萄糖消耗与乳酸生成水平及HK2蛋白表达均明显升高(P<0.01),细胞凋亡率均显著降低(P<0.01),显著抑制caspase-3的表达(P<0.01)。6、与sh-NC组相比,sh-SNHG1组肿瘤体积与重量均明显降低(P<0.01),肿瘤组织中SNHG1的表达水平显著降低(P<0.01),而mi R-101-3p的表达水平显著增加(P<0.01),SEC24A的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:Lnc RNA SNHG1在胃癌组织及细胞中呈高表达,mi R-101-3p下调表达,SEC24A上调表达,Lnc RNA SNHG1可促使mi R-101-3p表达水平降低,mi R-101-3p可直接靶向调控SEC24A表达,Lnc RNA SNHG1/mi R-101-3p/SEC24A调控网络在胃癌细胞迁移、侵袭及凋亡过程中发挥重要作用,其作用机制与降低胃癌细胞糖酵解水平有关,为揭示胃癌发生及发展的作用机制奠定理论基础,并可为胃癌诊断及治疗提供新方向。