吸烟有害健康,可以引发癌症,呼吸道疾病以及遗传病等,这些均与DNA的损伤密切关联,但烟草行业巨大的经济利益使得短时间内禁烟非常困难,因此研究烟雾成分对于DNA的损伤在环境监控,新药研发以及遗传疾病的早期诊治等方面具有重要的意义。近年来,寻找稳定的DNA损伤标志物,开发灵敏的DNA损伤评价技术正逐渐成为分析领域内很多学者关注的热点。同时,药学领域内的天然化合物研究也日趋成熟,全世界每年有数以千计的化合物单体从天然产物中分离出来,其中有些已被证实是非常重要的药学活性成分,要从这些丰富的资源中挑选出优良的特效成分单靠体内筛选技术无疑存在很大难度,因此先导天然化合物的体外高通量筛选技术日渐成为药物筛选的发展方向。本论文的重点即为构建香烟烟雾成分致DNA损伤的快速灵敏评价技术,进而研究DNA损伤的机理，筛选抗DNA损伤的天然化合物保护剂。文中对DNA损伤的评价创新性地偶合了快速的磁性分离技术与高灵敏度且操作简便的化学发光(CL)传感技术,可以排除复杂烟雾成分对于检测的干扰。借助体外吸烟模拟技术,本文系统研究了吸烟引起的DNA损伤,筛选了多种抗DNA损伤天然化合物保护剂,探讨了DNA损伤机理,并考察了优良的DNA保护剂在质粒、细胞分子水平的保护作用。主要工作简述如下：第一章绪论第一节介绍了DNA损伤的研究意义及其进展。内容包括DNA损伤的形式,以及近几年来报道的一些特异性检测DNA损伤的新技术；第二节,主要介绍了吸烟诱导DNA损伤及抗DNA损伤方法的研究进展,提出抗DNA损伤的天然化合物研究具有重大意义；第三节,阐明了本论文的目的和意义,介绍了本论文的主要研究内容及创新之处。第二章8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)体外评价技术的初步构建香烟烟雾中存在大量的ROS自由基,很多研究报道其可以诱导DNA产生8-OHdG,因此本论文将8-OHdG作为DNA氧化损伤的生物标志物。第一节,利用竞争免疫反应考察了免疫方法检测8-OHdG的专属性。第二节,采用磁珠作为载体,结合CL酶联免疫检测技术(CL ELISA),借用能够产生羟基自由基的Fenton试剂作为氧化源,构建了基于磁珠的8-OHdG体外CL评价体系,由以下步骤组成：(1)以共价键将DNA固定在磁珠表面,Fenton试剂体外染毒固定化的DNA；若研究天然化合物的保护作用,则在此步骤中加入一定量的天然化合物,与DNA,Fenton试剂共同孵育一段时间；(2)磁性分离去除染毒剂等杂质,保留氧化损伤的DNA,从而消除组成复杂的反应副产物等对测定的影响；(3)加入8-OHdG抗体,与氧化损伤产生的8-OHdG发生免疫反应,加入酶标第二抗体；(4)加入酶催化CL底物,高灵敏度CL法检测DNA氧化损伤产生的8-OHdG。结果发现：加入Fenton试剂的氧化组信号明显高于非氧化组,且与Fenton试剂的剂量正相关,考察了9种天然化合物对Fenton试剂诱导8-OHdG产生量的影响,发现黄酮类的槲皮素、柚皮素以及蒽醌类的大黄素都有明显的抑制作用,推测与其清除羟基自由基的活性有关；在第二节构建的技术路线基础上,第三节将简单的Fenton试剂氧化源更换为‘离线’的吸烟产物,即自动吸烟机吸烟后‘吐出’的尾部烟气经气袋等载体收集后,再溶解成溶液与DNA作用,发现也可诱导DNA产生8-OHdG,考察了11种天然化合物对这种氧化源所致的DNA碱基损伤的影响,发现其中的槲皮素、大黄素、阿魏酸、银杏酸、人参皂苷、黄芪甲苷、异嗪皮定、柚皮素等具有非常明显的抑制作用,与文献报道这些成分清除超氧自由基、羟基自由基等的活性相关。第三章在线吸烟诱导8-OHdG形成及天然保护剂筛选吸烟者吸烟直接吸入体内的烟雾称为主流烟气,其成分复杂,本章利用吸烟主流烟气瞬时捕集的方法,进一步研究了在线吸烟诱导DNA产生8-OHdG的情况,其主要步骤是在前一章的基础上,将固定有DNA的磁珠分散在气体捕集器中,与吸烟机通路串联,吸烟产生的主流烟气即刻与气体捕集器中的固定化DNA作用,因此DNA氧化更为剧烈,反应较短时间后,即可检测到8-OHdG产生的明显信号。此研究中在线吸烟机与气体捕集器结合,使得操作也更为简便,适用于高通量筛选天然化合物。优化体系反应条件后,我们筛选了包括黄酮类、蒽醌类、有机酸、有机碱等在内的32种天然化合物,发现槲皮素、黄芩素和丹参素钠三种天然化合物即使在DNA强氧化条件下,对DNA保护作用还非常明显。进一步考察其量效关系后,将此方法中磁性分离的优点拓展应用到从复杂化合物(如粗提物)中筛选有效成分的领域,更进一步评价了这些天然化合物添加到香烟烟丝的效果,发现这类香烟对DNA的损伤程度明显改善。研究结果表明,本实验筛选出的天然化合物在抗DNA损伤方面具有应用潜力。第四章在线吸烟诱导DNA断链及天然保护剂筛选本章研究了在线吸烟引起DNA断链的情况,构建了磁珠表面固定FAM-DNA模型,利用酶标FAM抗体检测DNA的CL生物传感技术,即荧光素(FAM)标记的靶DNA通过羧基-氨基反应固定在磁珠表面,在线吸烟作用下,DNA发生断链,含有FAM标记的断链部分脱离磁珠，洗涤磁珠后,酶标记的FAM抗体特异性识别保留在磁珠上的未断链的FAM-DNA,通过酶催化底物产生CL信号获得未断链的DNA量,从而间接算出断链DNA量,灵敏度可达pmol级别；另外,检测前磁性分离洗涤步骤,有效地去除了杂质对DNA测定的干扰。实验证明：吸烟导致DNA断链,且与烟气量以及烟气作用时间在一定程度内呈正相关,之后趋于饱和；该技术不仅可以用于评价烟气遗传毒性,而且可以用于筛选DNA保护剂。考察了30多种天然化合物对在线吸烟主流烟气引起的DNA断链的影响,发现槲皮素、黄芩素等可以明显抑制DNA断链,与上一章中筛选结果相符,此模型同样适合于DNA保护剂的高通量筛选。第五章在线吸烟诱导DNA损伤的机理研究香烟烟雾成分中复杂的ROS体系不仅引起DNA中某个碱基的结构改变,还会引起DNA链的断裂,本章初步探讨了DNA碱基损伤与断链的关系,以及DNA断链的机理。首先,将FAM通过乙二胺连接到羧基磁珠表面形成复合物,结果发现主流烟气对FAM结构和羧基-氨基连接方式并无明显影响,验证了第四章中固定化的FAM-DNA经历在线吸烟主流烟气作用后,磁珠表面信号降低确实是由于DNA断链引起的；另外非固定化DNA在线氧化后,LC-MS系统检测到DNA确实受到损伤。其次,将FAM标记的DNA固定于磁珠载体上,在线吸烟主流烟气与DNA作用后,分别检测其产生的8-OHdG以及DNA断链的情况,发现在线吸烟使这两种损伤同时出现,通过与前几章研究的DNA序列的对比,发现DNA在磁珠上的覆盖密度以及DNA碱基排列次序决定了两种损伤的程度；覆盖密度较大时,两种损伤均出现,且从DNA链外侧向靠近磁珠表面的内侧方向进行；覆盖密度较小时,DNA上可被ROS进攻的位点变少,两者反应的几率也变小,断链不明显,主要检测到碱基损伤。再次,不同类型的FAM-DNA在相同的烟雾作用条件下断链的情况有差异：同为10个碱基的不同序列单链DNA断链程度相当,30个碱基的长链DNA断链程度相对剧烈。以上结果证明了ROS自由基引起DNA断链的重要机制—DNA脱氧糖环上的氢被抽提,引起断链。DNA链上每个脱氧糖环都有5个位置含氢,具备了丰富的ROS自由基等的进攻位点,同是单链DNA,碱基越多,进攻的位点也越多,断链程度因此更为剧烈。另外10个碱基的双链DNA,由于具有更加复杂的立体结构,使得自由基等被捕获后,在链间寿命得以延长,故比相同长度的单链DNA,呈现较为严重的DNA断链。第六章天然保护剂对质粒DNA以及细胞损伤的保护作用为了使前两章筛选出的DNA天然保护剂可靠地应用于真实DNA样品以及细胞水平DNA的保护,本章以传统的质粒DNA以及两种细胞为研究对象,分别采用琼脂糖凝胶电泳法和碱性单细胞凝胶电泳法检测了烟雾主流烟气诱导的DNA损伤,以及上述几种DNA天然化合物保护剂对于真实DNA的保护作用,并进一步采用MTT法考察了这些保护剂对于细胞活力的影响。这些传统的DNA损伤研究结果均表明,吸烟主流烟气确实引起质粒DNA以及细胞DNA断链,且断链程度与烟气量以及烟气与DNA作用时间在一定范围内呈正相关；上述研究证明对于人工合成DNA有良好保护作用的天然化合物对质粒DNA以及细胞DNA也显示出良好的保护作用,对于细胞活力也有很好的维持作用。这个结果进一步验证了本论文建立的高通量筛选方法筛选出的DNA天然保护剂可靠性；也说明本论文构建的DNA损伤评价新技术可以在一定程度上,代替细胞及生物DNA损伤评价模型,改善传统方法中样品收集繁琐,检测方法灵敏度欠佳等现状,有望应用于DNA天然保护剂的高通量筛选。