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研究目的:组蛋白伴侣最初被认为是组蛋白的载体,随着研究的进一步深入,现在被认为是在组蛋白转运的各个阶段起着关键调节因子的作用。特定的组蛋白伴侣可以促进特定的组蛋白组装成核小体,这一过程是在新合成或者DNA修复过程中染色质重组的一个重要步骤,在DNA复制和修复过程中组蛋白伴侣对于染色质组装的调节起着非常重要的作用。H3-H4的组蛋白伴侣anti-silencing function1(ASF1)在染色质组装过程中起着非常关键的作用,虽然有报道称组蛋白伴侣ASF1A在包括乳腺癌在内的多种肿瘤组织中失调,但是ASF1A的丰度和功能是如何被调控的,其具体的分子机制尚不明确。Ubiquitin-specific peptidase 52/poly(A)nuclease 2(USP52/PAN2)是泛素特异性蛋白酶(USP)超家族的一个成员,它包括一个WD40重复结构域,一个泛素C端水解酶(UCH)结构域和一个属于DEDD超家族的C端RNA酶结构域。根据以前的研究,USP52在PAN2/PAN3脱腺苷化复合体中被描述为一个聚腺苷核酸酶,并且最近一篇报道称USP52是P-body(processing body)的一个关键组分,并且行使着阻止HIF1A信使RNA降解的功能。尽管酵母和真菌的直系同源催化结构(UCH结构域)的分析表明其缺少去泛素化蛋白酶活性所需的催化残基,但是USP52是否有能力去除泛素的链接还是一个开放性话题。该研究拟以鉴定USP52的蛋白质去泛素化酶活性以及其在乳腺癌发生发展中的作用为研究目的,致力于深入阐明USP52调节ASF1A蛋白水平稳定性的机制以及这一过程对于细胞染色质组装和肿瘤细胞增殖的影响。研究结果:1.组蛋白伴侣ASF1A能够与USP52相互作用。ASF1A与USP52相互作用是通过ASF1A的N端区域与USP52的WD40重复结构域产生的。ASF1A与USP52共同存在于一个不含有PAN3和组蛋白H3的蛋白复合体中。2.USP52是一个真正的去泛素化酶。昆虫细胞和哺乳动物细胞中纯化出来的USP52重组蛋白能够剪切K6-、K11-、K48-、K63-和M1-连接形式的泛素链,这说明了USP52能够剪切特异性的泛素链,并且是一个真正的去泛素化酶。3.USP52能够去泛素化ASF1A。一系列的去泛素化实验和ASF1A泛素连接位点质谱分析证明了USP52能够有效去除野生ASF1A上面的K48连接形式的泛素链,并且USP52去泛素化ASF1A的位点发生在第129位的赖氨酸上。4.USP52稳定ASF1A。蛋白酶体抑制剂MG132的检测分析说明了ASF1A是USP52的一个底物。CHX实验说明了USP52的缺失与ASF1A半衰期的减少密切相关。总的来说USP52能够控制ASF1A稳定性。5.USP52通过稳定ASF1A来促进染色体组装。MNase消化实验和EDU染色的结果支持了USP52能够通过促进ASF1A的稳定来调节DNA复制过程中ASF1A介导的H3K56Ac的沉积以及调节细胞S期的进程。6.USP52/ASF1A信号与乳腺癌的发生发展有关。免疫组织化学染色分析结果表明USP52和ASF1A在多种乳腺癌样品中都高表达,并且两者的表达水平高度正相关,克隆形成实验表明了USP52/ASF1A信号轴也是乳腺癌细胞生长所需。乳腺癌细胞异种移植到小鼠的实验结果也指出了USP52促进ASF1A稳定在促进乳腺癌发生中的作用。7.USP52/ASF1A信号能够增加DNA损伤的耐受性。一系列由IR或CPT诱导的细胞凋亡实验揭示了USP52促进ASF1A的稳定能够支持乳腺癌细胞对于DNA损伤的抵抗。研究结论:在这里我们报道了ASF1A能够与USP52相互作用,并且证明了USP52是一个真正的去泛素化酶。我们通过大量的实验证明了高等生物而非原核表达纯化的USP52不仅能去除多种特异连接类型的多聚泛素链,而且能去除ASF1A蛋白上面的K48连接形式的多聚泛素链从而起到稳定ASF1A的作用。另外我们发现USP52/ASF1A能够促进ASF1A介导的H3K56Ac的生成及组蛋白在染色质上的沉积,进而促进复制过程中染色质组装,对基因组稳定性具有重要作用。在临床组织样本分析中,我们发现USP52与ASF1A在各种类型的乳腺癌组织中高表达,且二者的表达水平呈正相关。另外我们对USP52/ASF1A对细胞毒性的研究发现它对抵抗DNA损伤起到重要作用。根据这些证据,我们的实验结果提示USP52/ASF1A可能作为一个治疗乳腺癌的潜在靶点。