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1.研究目的:尽管动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发病机制目前还不是十分清楚,但是越来越多的证据表明,动脉粥样硬化是一种炎症免疫性疾病。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APC),能有效地摄取和处理抗原,并将抗原递呈给T淋巴细胞,从而激发免疫应答,并在免疫应答的诱导和调节中发挥关键作用。DCs和氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins, ox-LDL)是目前公认的致动脉粥样硬化因素,与AS的发病有着密切的联系。多种研究表明ox-LDL可以促进DCs的活化和成熟,诱发一系列的免疫炎症反应促进AS的发生和发展,但其具体机制目前尚不清楚。为了解决这个问题我们应用同位素标记蛋白质相对和绝对定量分析(isobaric tagging for relative and absolute quantitation, iTRAQ)的方法检测DCs被ox-LDL刺激活化前后蛋白表达的变化。2.研究方法:(1)、DCs的培养和鉴定:颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠,取股骨和胫骨,获得骨髓来源的单细胞悬液。利用rmGM-CSF和rmIL-4诱导单个核细胞向分化为DCs,培养至第7天收获细胞备用。(2)、DCs的干预:DCs培养至第7天,不成熟DCs用10(μg/ml oX-LDL刺激24小时。(3)、DCs表型分析:应用流式细胞分析仪,检测DCs表面成熟标志。(4)、细胞因子的检测:2组DCs细胞培养24小时,收集细胞培养上清液,应用ELISA试剂盒检测白介素-12(Interleukin-12, IL-12)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα, TNF-α)。(5)、应用iTRAQ技术检测2组DCs蛋白表达的差异。(6)、Western blot分析:应用Western blot验证部分差异蛋白的表达。(7)、建立ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化模型,检测组织蛋白酶s及DCs在对照组和瑞舒伐他汀治疗组动脉粥样硬化斑块中的表达。3.实验结果(1)、DCs培养7天,空白对照组低表达表面成熟标志CD80,CD86,MHCⅡ和CD40,经ox-LDL刺激24活化后这些表面成熟标志高表达。(2)、2组DCs培养24小时,收集细胞培养上清液用ELISA试剂盒检测IL-12和TNF-α的表达。实验结果表明,oX-LDL的刺激能够明显增加细胞因子IL-12和TNF-α的分泌。(3)、应用iTRAQ检测2组DCs差异蛋白的表达,我们共检测到781个蛋白,其中有178个表达增高,有100个表达降低。所检测到的差异蛋白分别参与细胞免疫反应,脂质代谢,氧化应激和细胞结构调节等多个重要的过程。其中多个蛋白与动脉粥样硬化的发病有密切的联系,如组织蛋白酶类,热休克蛋白等。其中最有意义的发现是,ox-LDL能够使DCs高表达组织蛋白酶S,Z,D和G。(4)、我们应用Western blot验证了其中8个表达增高的蛋白,Western blot结果中的蛋白表达趋势和iTRAQ实验结果一致。(5)、组织蛋白酶S及DCs在ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化斑块内高表达,瑞舒伐他汀治疗能够明显减小斑块面积和降低动脉粥样硬化斑块内组织蛋白酶s和DCs在斑块内的表达。4.展望DCs在炎症免疫反应和动脉粥样硬化的发生和发展过程中起重要的作用。本实验应用iTRAQ检测ox-LDL刺激对DCs蛋白表达的影响。我们的实验第一次证明ox-LDL可以使DCs内多种组织蛋白酶表达增高。我们的实验结果可能为更深层次的理解动脉粥样硬化的发病机制提供一定的理论依据。