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第一部分HDAC2影响激素治疗突发性聋的临床效果观察目的:由于糖皮质激素（glucocorticoids,GCs）可以透过圆窗膜,因而GCs鼓室注射被试用于突发性聋（sudden sensorineural hearing loss,SSNHL）治疗,取得了一定的疗效,但同时部分患者也存在GCs抵抗现象。近来研究显示GCs抵抗与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase 2,HDAC2）功能下降关系密切。本课题主要观察HDAC2对鼓室注射甲基泼尼松龙（Intratympanic Methylprednisolone Perfusion,IMP）治疗SSNHL效果的影响。方法:收集2013年1月至2015年7月因常规治疗失败在南京医科大学鼓楼临床医学院采用IMP进行挽救性治疗的SSNHL患者34例。检测IMP前、IMP后、及发病后3个月内平均纯音听阈（Pure-tone average,PTA）,观察IMP治疗难治性SSNHL的效果。同时在治疗前后各抽取20ml外周静脉血,提取外周单核细胞（peripheral mononuclear cells,PBMCs）备用。根据PTA改善是否≥15dB,将SSNHL患者分为鼓室灌注敏感组（intratympanic methylprednisolone perfusionsensitive,IMPS）（PTA≥15dB）和鼓室灌注不敏感组（intratympanic methylprednisolone perfusion insensitive,IMPI）（PTA<15 dB）。采用酶联免疫法及Western blot方法,对比两组患者PBMC中HDAC2及组蛋白H3、H4乙酰化水平,观察HDAC2与SSNHL治疗效果之间的关系。结果:34例难治性SSNHL患者经IMP治疗后,11例PTA改善≥15 dB,其中4例PTA改善≥30 dB,有效率为44.11%。0.25kHZ、0.5kHZ、1kHZ三个频率PTA平均改善17.94±20.11dB,2kHZ、4kHZ、6kHZ三个频率PTA平均改善5.65±13.17dB。34例难治性SSNHL患者PBMC中HDAC2水平低于正常参考值,而H3、H4组蛋白乙酰化水平高于正常参考值。经过10天的IMP治疗,IMPS组HDAC2蛋白水平升高,H3、H4组蛋白乙酰化减低,而在IMPI组无明显变化。Western blot也直观显示了这一变化。结论:常规治疗效果欠佳的SSNHL患者经IMP治疗后听力仍可获得改善。能否提升HDAC2、降低H3、H4乙酰化水平将影响IMP对常规治疗效果欠佳的突发性聋患者疗效。第二部分HDAC2影响耳蜗细胞凋亡的分子机制目的:我们前期研究中发现HDAC2降低可影响IMP对难治性SSNHL患者的治疗效果,但其具体作用机制尚不清楚。有研究报道SSNHL患者听力下降与耳蜗细胞凋亡有关,本实验主要研究HDAC2对耳蜗毛细胞凋亡的影响。方法:首先用鼓阶内注射脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）法构建急性听力损失豚鼠模型,同时在低氧条件下培养耳蜗HEI-OC1细胞（cochlear cell line,HEI-OC1）建立低氧耳蜗毛细胞模型。采用免疫组化方法观察LPS豚鼠耳蜗内细胞凋亡情况,随后通过实时定量PCR（quantitative Real-time Ploymerase Chain Reaction,q RT-PCR）及Western blot法在基因及蛋白水平检测LPS豚鼠模型耳蜗基底膜提取细胞及低氧模型中HEI-OC1细胞的HDAC2及凋亡相关基因cleaved-caspas3,cleaved-caspas9,cleaved-PARP,Bcl-2,Bcl-xl水平,证实HDAC2降低与耳蜗毛细胞的凋亡关系。通过多种在线分析工具Ven图找到可能涉及HDAC2对耳蜗细胞凋亡负调控基因Bcl-2调节的小分子RNA:mi R-204-5p和miR-211-5p。随后通过转染si-HDAC2及加入mi R-204-5p抑制剂的HEI-OC1细胞,明确mi R-204-5p及mi R-211-5p是否参与HDAC2介导的Bcl-2调节。通过Mir204结构分析,发现其启动子区域存在多个SP1结合位点。进一步使用荧光酶报告法观察SP1结合位点突变及共转染si-SP1,对转染si-HDAC2导致Mir204启动子活性变化影响。同时采用免疫共沉淀法及染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation,CHIP）分析SP1是否参与HDAC2对mi R-204-5p的调节。最后采用转染si-HDAC2及共转染mi R-204-5p抑制剂或Bcl-2激动剂观察耳蜗HEI-OC1细胞的活性及凋亡变化。结果:LPS鼓阶灌注豚鼠的脑干听觉诱发电位（auditory brainstem response,ABR）阈值明显提高,细胞凋亡增加。不管LPS鼓阶灌注的豚鼠模型还是低氧的HEI-OC1细胞,HDAC2、Bcl-2和Bcl-xl蛋白明显低于对照组,cleaved-caspas3,cleaved-caspas9,cleaved-PARP蛋白均明显高于对照组。q RT-PCR显示LPS豚鼠耳聋模型的耳蜗细胞HDAC2、Bcl-2、Bcl-xl明显均低于对照组,两者呈正相关,低氧的HEI-OC1细胞中HDAC2、Bcl-2、Bcl-xl亦明显低于对照组。这提示HDAC2降低与耳蜗毛细胞凋亡增加有关。多种在线分析工具的Venn图提示mi R-204-5p和mi R-211-5p可能涉及HDAC2对Bcl-2基因的调节。转染si-HDAC2后,HEI-OC1细胞mi R-204-5p升高,而mi R-211-5p变化不明显。LPS豚鼠耳蜗基底膜细胞中mi R-204-5p明显高于对照组。转染si-HDAC2后HEI-OC1细胞内Bcl-2的蛋白和RNA水平均降低,降低程度可被加入mi R-204-5p抑制剂逆转。这提示HDAC2可通过mi R-204-5p来调节HEI-OC1细胞的Bcl-2水平。Mir204启动子区域存在多个SP1结合位点,Sp1位点突变后转染si-HDAC2对Mir204启动子活性升高影响被减弱。q RT-PCR也发现转染si-HDAC2后mi R-204-5p上调,而共转染si-SP1及si-HDAC2后,si-HDAC2上调mi R-204-5p趋势被减弱。随后免疫共沉淀法进一步明确了HDAC2和SP1可以结合,CHIP法证明了HDAC2和SP1存在共同的结合位点P1和P2,转染si-HDAC2后可使Mir204启动子的SP1位点组蛋白H3乙酰化水平升高。最后用si-HDAC2和mi R-204-5p抑制剂或Bcl-2激动剂,共转染HEI-OC1细胞,发现转染si-HDAC2引起的细胞活性降低及细胞凋亡增加可被mi R-204-5p抑制剂或Bcl-2激动剂部分逆转。结论:本研究显示HDAC2通过HDAC2/SP1/mi R-204-5p/Bcl-2调节轴参与SSNHL的耳蜗毛细胞凋亡调节。