结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌，结核病在全球范围有很高的发病率和致死率。目前全球每年约有9百万新感染患者，造成约150万死亡。结核病已成为单一因素导致死亡的传染病的头号杀手。缺乏有效的疫苗及耐多药结核菌的流行传播是防治结核病面临的严峻挑战。目前仅有的结核病疫苗卡介苗仅对儿童有保护作用，而对成人的结核病预防作用很弱。同时能有效治疗结核病—尤其是耐多药结核病的药物种类非常有限。结核分枝杆菌通过分泌毒力蛋白来调节其毒力和发病过程。毒力蛋白通过ESX-1等分泌系统分泌。ESX-1分泌系统的组分已经陆续被发现，但分泌机制仍然未知。ESX-1系统的重要组分EspB对于结核分枝杆菌的毒性及其在巨噬细胞内的生长密切相关。据报道，EspB在ESAT6和CFP10的分泌及抑制吞噬体成熟过程中发挥重要作用，能抑制小鼠巨噬细胞中自噬体的形成并下调γ干扰素受体1的表达。目前对于ESX-1系统如何分泌EspB仍然知之甚少。有报道称EspB的分泌依赖其与ESAT6和CFP10的结合。而另一项研究则认为EspB的分泌需要与EspK的相互作用。EspB分泌的分子机制尚有待进一步研究来阐释。猪链球菌(Streptococcus suis)是一类重要的人畜共患病病原菌，可引起中毒性休克综合征，对人类健康构成了极大威胁。目前没有疫苗能够有效预防人类感染这种细菌。前人研究发现在猪链球菌感染过程中，利用了宿主细胞外基质分子如纤连蛋白(fibronectin)，血纤维蛋白溶酶原，胶原蛋白以及纤维蛋白原。猪链球菌与宿主细胞的相互作用通过纤连蛋白结合蛋白(FBPS)介导。FBPS是一类在细菌表面广泛存在的保守组分，在其它重要的革兰氏阳性细菌中能够识别粘附宿主细胞的基质分子。FBPS为无锚定粘附素家族成员，与其它纤连蛋白同源性很低。FBPS与纤连蛋白间的相互作用研究目前还不够深入，缺乏对其互作机制的了解。　　本研究通过对结核分枝杆菌和猪链球菌毒力蛋白的特征研究，阐明它们的分泌机制及其在致病中的作用机制。我们检测了结核分枝杆菌的分泌蛋白ESX-1与EspB，EspC，EspK，ESAT6，及CFP10的相互作用，为阐明EspB的分泌机制奠定了基础。同时，我们研究了ESAT6与人TLR-2之间的相互作用。为了揭示纤连蛋白结合蛋白(FBPS)在猪链球菌感染过程中发挥的作用，我们还解析了FBPS的蛋白结构并阐明了其与纤连蛋白(fibronectin)N端结构域间的互作的分子基础。所有的细菌重组蛋白在E.coli中表达。人的纤连蛋白N端分别在E.coli和哺乳动物细胞中表达。人TLR2蛋白的胞外端使用杆状病毒表达系统表达。大量表达的蛋白通过亲和层析与分子筛纯化，纯度使用SDS凝胶电泳鉴定。蛋白之间的相互作用通过凝胶过滤及表面等离子共振等方法测定。蛋白质晶体筛选使用坐滴法完成。蛋白晶体数据通过X射线衍射获取，蛋白结构利用分子置换法进行解析。FBPS蛋白的N和C末端的组织结构通过X射线小角散射分析阐明。发现EspB与EspK之间存在相互作用，亲和力为13μM。这一结果表明EspB靶向ESX1分泌机器可能需要与EspK的参与。然而我们未能获得EspK和EspB的复合物晶体，其中EspB单体能够结晶，而EspK不能。此外，EspB与ESAT6、CFP10或EspC没有结合，暗示这些蛋白质不与EspB共同分泌。SPR结果也显示，ESAT6与人TLR-2只发生微弱的结合，响应值很低。暗示着ESAT6与TLR2的体内互作可能需要另一个未知的宿主因子介导。由于EspC蛋白也不能形成晶体，我们无法解析其结构。为了研究EspC是否能正确折叠，我们进行了圆二色谱实验，结果表明在溶液中，EspC蛋白的二级结构中存在α螺旋。我们进一步尝试用核磁共振方法解析EspC蛋白的结构，但是二维谱图像中仅观察到30个氨基酸（总共106个氨基酸）。另外，EspC，ESAT6和CFP10之间也没有互作，说明在ESX-1系统中，这些蛋白不是同时分泌的。由于猪链球菌的FBPS全长蛋白在结晶时发生降解，我们分别解析了FBPS N端和C端两部分结构。FBPS-N端的整体结构是由12个β折叠(β n1-β n12)和7个α螺旋(αn1-α n7)组成。可以分为两个不同的结构域(DⅠ和DⅡ)，一个额外的小螺旋(α n7)和两个非常长的环连接DⅠ、DⅡ和小螺旋。DⅠ由7个表面螺旋和环状结构包裹着β桶核心区组成。在拓扑结构上，DⅠ的残基先组装成α螺旋(αn1)、4个片层折叠及4个连续的反向平行β链(β n1-β n4)，然后通过一个环状结构连接β n1-β n4以形成另一个α螺旋(α n2)及包含β n5-β n9的后部片层。在空间上，两个螺旋稳固了对侧的两个筒状片层。DⅠ通过一个长的内环与DⅡ相连。与主要由β折叠构成的DⅠ不同，N端的DⅡ是一个纯粹的α螺旋结构。在该结构域中，4个螺旋(αn3-α n6)聚在一起，形成了一个独立的束状折叠。紧临这一结构，α n6/7内环伸向DⅠ的β n4-α n2桥环。αn6/7内环朝DⅠ上的β n4-α n2桥翻折，形成两段短的β链（β n10-β n11），呈反向平行排列形成了一个小的β发卡结构。发卡结构与N端的α n7螺旋形成酪氨酸介导的氢键（K237-Y264和Y239-Y265）。同时，α n7螺旋的结构通过与DⅠ的β n4-α n2桥间的氢键作用力更加稳定。在FBPS-C的晶体结构中，T320到P354在αc1和αc2间由于形成柔性区在结构上是不可见的。FBPS-C的结构包含了7个α螺旋和6个β折叠。该结构可以分成两个结构域（DⅠ和DⅡ），其中DⅠ为螺旋结构包含3个连续的α螺旋。前两个螺旋(αc1-αc2)长度分别为74(A)和64(A)，排列成有20。内角的交叉卷曲螺旋。DⅡ末端通过一个由33个氨基酸(T320-P354)组成的长的柔性环（α c1/α c2环）与DⅠ螺旋连接。DⅠ的第三个螺旋α c3定位于螺旋结构的纵面，靠近DⅡ，与αc1和αc2组成稳定的3螺旋束。DⅡ结构域包含E432到I552，整体呈现为球状折叠。DⅡ由6个反向β链(βc1-β c6)和4个α螺旋组成。α c5位于由β c1-β c6与α c6、α c4形成的环状结构中心，通过与DⅠαc3的氢键作用稳定结构。在拓扑结构上，DⅡ呈现出具有3个串联排列ββα模序(motif)的新型结构。　　本研究利用小角散射方法把FBPS的N端和C端结构整合得到全长蛋白的结构。大致上，FBPS由14个α螺旋(α1-α14)和15个β折叠（β1-15β）组成。FBPS的连接区位于N端和C端的α7和α8之间。FBPS有四个结构域平均地分布在N端及C端中。DⅠ和DⅡ的关系类似于站在石头上的一只鸟，C端DⅠ如同鸟的头部和颈部，DⅡ如同鸟的身体;而N端的对应结构域就如同石头。α c1/α c2长环构成了头和喙的可变区。这两个结构域相距10(A)，刚好是结构数据中缺失的3个氨基酸(269-271)形成的距离，很可能与一个柔性环状结构相连构成了鸟腿部分。与纤连蛋白的结合实验表明，全长FBPS及FBPS-C表现出相似的结合动力学特征(KD=370 nM)。FBPS-N只有在浓度达到30μM时才能检测到与纤连蛋白的微弱结合。而FBPS与阴性对照如:胶原蛋白(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，andⅤ)及BSA，仅在浓度达到50μM时才能检测到低水平的结合。这一结果表明FBPS与纤连蛋白的结合是特异的，并且结合位点位于FBPS C端而不是N端。综上所述，数据显示结核分枝杆菌的EspB与EspK发生相互作用，却不与ESAT6或CFP10结合。这可能是ESX-Ⅰ系统分泌的先决条件。另外，我们的结果还表明猪链球菌利用FBPS与宿主的纤连蛋白相互作用，这为进一步揭示FBPS在猪链球菌致病过程中作用奠定了分子基础。