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目的:巴马亭(palmatine)是一种天然异喹琳类生物碱,具有抗菌、抗炎及抗癌症等多种药理活性,在临床上用于治疗胃炎、肠炎及盆腔炎等。本研究探讨巴马亭对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的保护作用,并考察其可能的作用机制。方法:1.巴马亭缓解DSS诱导的小鼠UC药效研究体内实验将雄性Balb/C小鼠随机分为6组,即空白对照组、DSS模型组、巴马亭低、中、高剂量组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组。空白对照组自由饮用蒸馏水,其余各组小鼠连续7天自由饮用3%DSS溶液建立小鼠UC模型。在造模同时,巴马亭(10、40、100 mg/kg)以及SASP(200 mg/kg)分别灌胃给药,连续给药7天,空白对照组与DSS模型组灌予同体积蒸馏水。记录实验期间各组小鼠每天的体重变化以及便血情况。实验结束后分离结肠、记录结肠长度;H&E染色观察结肠组织病理变化;检测结肠组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性,免疫荧光法检测组织中巨噬细胞成熟分子F4/80的表达及分布;ELISA法检测组织细胞因子IL-1β与TNF-α含量,并用Western blot技术检测组织中NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-lβ的表达。2.巴马亭作用机制研究(1)巴马亭对THP-1来源巨噬细胞(THP-Ms)NLRP3炎症小体活化的影响体外实验采用300 nM PMA刺激THP-1细胞24小时,将其诱导分化为巨噬细胞。用1 μg/mLLPS刺激细胞3小时后改用5 mMATP刺激1小时建立NLRP3炎症小体活化模型,随后巴马亭(50、100、200 μM)干预3小时。采用Western blot技术检测细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-lβ的表达,并用免疫荧光法检测细胞中caspase-1与ASC的表达及分布,最后用ELISA法检测细胞上清液中细胞因子IL-1β的含量。(2)巴马亭对THP-Ms线粒体自噬的作用按照上述细胞分化、造模及给药后,使用流式细胞术检测细胞中线粒体ROS的水平,并采用Western blot技术检测细胞及线粒体中线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62的表达;同时应用免疫荧光分别标记线粒体外膜蛋白TOM20及线粒体自噬蛋白PINK1检测线粒体自噬情况;以及用免疫荧光法检测自噬底物P62的分布,最后用Mitotracker与lysotracker分别标记线粒体与溶酶体后检测线粒体与溶酶体的结合情况。(3)抑制THP-Ms线粒体自噬后,观察巴马亭是否仍能抑制NLRP3炎症小体活化体外实验将细胞分化至THP-Ms后,1 μg/mL LPS刺激细胞3小时后改用5 mMATP刺激1小时,并用200 μM巴马亭与5 nM线粒体自噬抑制剂环孢菌素A(Cyclosporin A,CsA)共同干预3小时。采用Western blot技术检测细胞中caspase-1与PINK1蛋白的表达,并用ELISA法测定细胞上清液中IL-1β的含量。(4)沉默PINK1的表达后,研究巴马亭对NLRP3炎症小体作用体外实验将细胞分化至THP-Ms,用PINK1-siRNA沉默THP-Ms中PINK1的表达。随后用1 μg/mLLPS刺激3小时并用5 mMATP刺激1小时后,用200μM巴马亭干预3小时。实验结束后采用Western blot技术检测细胞中caspase-1与PINK1蛋白的表达,并用ELISA法测定细胞上清液中IL-1β的含量。3.体内抑制线粒体自噬,验证巴马亭对结肠炎小鼠NLRP3炎症小体的作用将雄性Balb/C小鼠随机分为5组,即空白对照组、DSS组、巴马亭组、巴马亭+CsA组、CsA组。空白对照组自由饮用蒸馏水,其余各组小鼠连续7天自由饮用3%DSS溶液建立小鼠UC模型。在造模同时,空白对照组与DSS模型组给予同体积蒸馏水,巴马亭组(100 mg/kg)灌胃给药,CsA(20mg/kg)腹腔注射给药,各组小鼠均连续给药7天。记录实验期间各组小鼠每天的体重变化与便血情况。实验结束后分离结肠、记录结肠长度;并用ELISA法检测组织中IL-1β与TNF-α的含量,最后运用Western blot技术检测组织中PINK1、Parkin、LC3、caspase-1与IL-1β蛋白的表达。结果:1.体内实验结果表明,DSS导致小鼠体重下降且出现便血、结肠缩短以及严重结肠损伤现象;此外,小鼠给予DSS后结肠组织MPO活性增加以及细胞因子IL-1β、TNF-α水平升高;并从免疫荧光与Western blot结果可观察到DSS小鼠结肠组织中巨噬细胞活化明显,且NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase-1 和 cleaved-IL-1β 表达量增加。而巴马亭(40,100 mg/kg)能显著改善DSS诱导的结肠炎小鼠的病理症状,并降低小鼠结肠组织中MPO活性以及细胞因子IL-1β、TNF-α的分泌;此外,巴马亭还减少DSS小鼠结肠中巨噬细胞的活化以及 NLRP3、cleaved-caspase-1 和 cleaved-IL-1β 蛋白的表达。2.体外实验显示THP-Ms经LPS与ATP刺激后细胞中NLRP3、cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β蛋白的表达增加,细胞因子IL-1β的分泌增多,同时细胞线粒体中ROS的水平升高。而经过巴马亭(50、100、200 μM)干预后,THP-Ms 中 NLRP3、cleaved-caspase-1 和 cleaved-IL-1β 蛋白的表达降低,且细胞因子IL-1β的分泌以及细胞线粒体ROS的生成减少。同时,巴马亭干预后,总蛋白及线粒体中PINK1和Parkin的表达以及LC3-I向LC3-II的转换增加,并降低细胞中P62的表达。此外,巴马亭还促进THP-Ms中线粒体与溶酶体的融合。3.体外实验结果表明,当采用CsA抑制线粒体自噬后,巴马亭促进PINK1表达的作用减弱,且CsA降低巴马亭对cleaved-caspase-1蛋白表达以及IL-1β分泌的抑制作用。同样地,PINK1沉默后使巴马亭对cleaved-caspase-1蛋白表达以及IL-1β分泌的抑制作用减弱。4.体内实验结果显示,在CsA干预下,巴马亭改善DSS小鼠的UC症状减弱,且结肠组织中IL-1β、TNF-α分泌相对升高。此外,CsA降低巴马亭对组织中PINK1、LC3、Parkin表达的促进作用,并解除了巴马亭对cleaved-caspase-1和IL-1β蛋白的抑制作用。结论:巴马亭能减轻DSS诱导的小鼠UC症状,此作用可能与其增强巨噬细胞PINK1/Parkin信号介导的线粒体自噬,减少损伤线粒体的累积以及线粒体ROS的生成,从而抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活以及相关细胞因子的分泌有关。