【摘 要】
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纳米硒因其高效低毒特性已成为硒补充剂研制的热点,但其极不稳定、易聚集转变为灰黑色硒而失去活性。为提高纳米硒稳定性,本研究以云南大叶种绿茶、红茶、普洱茶,英红九号黄茶,福鼎大白白茶,岭头单丛乌龙茶,南昆山毛叶绿茶、红茶等不同品种、六大茶类多糖为模板,利用抗坏血酸（Vc）与亚硒酸钠（Na2Se O3）的氧化还原反应,制备稳定分散的纳米硒;从中选取不发酵的绿茶、半发酵的乌龙茶、发酵的红茶、后发酵的普洱茶
【基金项目】
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国家茶叶产业技术体系经费（CARS-19）；
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纳米硒因其高效低毒特性已成为硒补充剂研制的热点,但其极不稳定、易聚集转变为灰黑色硒而失去活性。为提高纳米硒稳定性,本研究以云南大叶种绿茶、红茶、普洱茶,英红九号黄茶,福鼎大白白茶,岭头单丛乌龙茶,南昆山毛叶绿茶、红茶等不同品种、六大茶类多糖为模板,利用抗坏血酸（Vc）与亚硒酸钠（Na2Se O3）的氧化还原反应,制备稳定分散的纳米硒;从中选取不发酵的绿茶、半发酵的乌龙茶、发酵的红茶、后发酵的普洱茶,探究反应物配比、模板添加量、反应时间、反应温度等反应条件对纳米硒稳定性的影响,建立相应的茶多糖-纳米硒制备方法。进而以绿茶多糖-纳米硒和普洱茶多糖纳米硒为研究对象,利用动态光散射、多普勒测速、电子显微镜、X射线衍射、X射线光电子能谱、红外光谱、X射线衍射等技术表征其基本形貌、结合方式、价态等特性,以人结肠癌细胞HCT116、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Hep G2、人前列腺癌细胞LNCap为体外肿瘤细胞模型评价抗癌活性,以人正常肝细胞L-O2为体外模型评价毒性;选出对癌细胞有较强抑制增殖的绿茶多糖-纳米硒,研究其纯化前后对稳定纳米硒的不同,进而研究绿茶多糖-纳米硒诱导人结肠癌细胞HCT116凋亡的相关机理,利用RNA-Seq技术对可能的细胞通路进行了预测。主要研究结果如下:1、构建并表征5个茶树品种、六大茶类茶多糖-纳米硒的基本特性六大茶类、8种茶样茶多糖均为多糖-蛋白复合物,以其为模板,均能制备出纳米硒悬液,但其稳定效果不同;其中,普洱茶多糖-纳米硒分散稳定性最好,粒径约为25～75 nm,Zeta电位值大于50 m V,静电稳定性高,纳米硒粒子呈球型。2、优化了云南大叶种绿茶等4种茶多糖-纳米硒制备方法通过单因素和正交试验得出的4种茶样制备纳米硒的优化条件:均为先添加Na2Se O3;云南大叶种绿茶多糖-纳米硒的Vc:Na2Se O3反应配比为4:1,绿茶多糖模板添加量为500 mg/L,分离方式为反应前透析;云南大叶种红茶多糖-纳米硒的Vc:Na2Se O3反应配比为6:1,红茶多糖模板添加量为400 mg/L,分离方式为反应前透析;云南大叶种普洱茶多糖-纳米硒的Vc:Na2Se O3反应配比为6:1,模板添加量为750mg/L,反应温度40℃,反应时间0.5 h,分离方式为反应后透析;岭头单丛乌龙茶多糖-纳米硒的Vc:Na2Se O3反应配比为6:1,模板添加量为500 mg/L,反应温度40℃,反应时间0.5 h,分离方式为反应后透析。3、以动态光散射、多普勒测速等技术表征了云南大叶种绿茶、普洱茶多糖-纳米硒的基本特性云南大叶种绿茶、普洱茶多糖-纳米硒的静电稳定性高,纳米硒颗粒表面由球型颗粒紧密堆积,含有Se、C、O元素,Se含量分别为97.27%、97.57%;多糖等的-OH与蛋白质中的-NH2以及多糖中的-C=O-通过诱导效应与硒结合,稳定分散纳米硒;且其均为零价无定型红色单质硒;硒浓度分别为11.20、11.41 mmol/L。4、研究了云南大叶种绿茶、普洱茶多糖-纳米硒对4种癌细胞增殖的抑制作用以及对人正常肝细胞L-O2细胞的毒性不同形式硒对HCT116、MCF-7、Hep G2、LNCap细胞增殖均有抑制作用,并呈剂量依赖关系。在测定的4种肿瘤细胞中,HCT116细胞对不同形式硒敏感性均最强;在不同形式硒中,无机硒对HCT116细胞的抑制作用最强,其IC50值为11.81μM;纳米硒中,绿茶多糖-纳米硒对HCT116细胞的抑制作用强于普洱茶多糖-纳米硒,其IC50值为16.50μM。当纳米硒的浓度大于250μM时,对人肝L-O2正常细胞有损伤。5、纯化绿茶多糖并研究纯化前后绿茶多糖-纳米硒抗癌活性及相关机理绿茶多糖经过DEAE-cellulose52柱层析后,得到TPS-Ⅰ、TPS-Ⅱ、TPS-Ⅲ、TPS-Ⅳ4种组分,其中TPS-Ⅲ得率最高,为26.49%;其单糖组成是半乳糖醛酸:阿拉伯糖:半乳糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:木糖:岩藻糖=80.02:7.78:6.78:3.02:0.86:0.23:0.19,分子量分布为1696～210389 Da。纯化前绿茶多糖-纳米硒抗癌活性强于纯化后绿茶多糖-纳米硒,且绿茶多糖-纳米硒可通过诱导细胞凋亡,从而抑制HCT116细胞增殖,但不是通过线粒体凋亡途径发挥作用。通过分析转录组数据,推测是通过p53通路导致细胞死亡的。
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