氨来呫诺(Amlexanox,ALX)具有抑制白三烯和稳定肥大细胞的作用,在复发性口腔溃疡和过敏性鼻炎治疗中具有卓越的表现,因而广泛在临床使用。近年来,ALX作为一种新型小分子TBK1特异性抑制剂,具有调节免疫反应和抗炎的作用,但其在中枢神经系统自身免疫性疾病的研究中知之甚少。本实验通过研究ALX对树突细胞(dendritic cell,DC)表型和功能成熟的影响,DC内TBK1/Akt通路蛋白表达的变化,进而探索其在EAE发病过程中的作用。体外实验结果显示,ALX抑制骨髓源性树突细胞(bone marrow-derived DC,BMDC)成熟及BMDC刺激的CD4+T细胞增殖。并且ALX抑制BMDC中TBK1/Akt通路的活性。在体实验结果显示,ALX具有缓解EAE发病,减轻脊髓炎症细胞浸润和髓鞘脱失程度的作用。ALX干预后,在周围免疫器官脾中,Th1和Th17细胞比例下降,脾细胞培养上清和血清中Th1和Th17细胞特异性炎症因子IFN-γ和IL-17分泌减少,以及Th1和Th17细胞特征性转录因子T-bet,RORγt m RNA转录水平下降;同样,在中枢神经系统(central nervous system,CNS)Th1和Th17细胞减少,IFN-γ和IL-17表达下降,IFN-γ,T-bet,IL-17和RORγt m RNA转录水平下降;说明,ALX可以抑制中枢和外周Th1和Th17细胞反应。本实验进一步对脾中起抗原呈递并且对初始T细胞分化起重要作用的树突细胞成熟程度进行检测,结果显示ALX干预后脾中CD80+DC和CD86+DC比例减少,DC成熟标记性表面分子CD80、CD86和MHC II平均荧光强度下降,血清和脾细胞培养上清中炎症因子IL-12和IL-23减少。此外,ALX抑制脾DC内磷酸化Akt的表达和TBK1活性。综上,本实验结果说明ALX可能通过抑制TBK1/Akt传导通路,影响DC成熟,进而抑制Th1和Th17细胞分化,从而在EAE中起到保护性作用。本实验为探索MS的发病机制及寻找临床安全有效的治疗药物提供实验依据。第一部分氨来呫诺抑制骨髓来源树突细胞表型及功能成熟并且可能同TBK1/Akt通路相关目的:以GM-CSF诱导骨髓干细胞生成未成熟BMDC,应用LPS刺激细胞成熟,应用ALX干预LPS诱导的BMDC成熟过程,观察对BMDC增殖情况,成熟表型及其刺激同种异基因CD4+T细胞增殖作用的影响。方法:1无菌条件下取雌性C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓进行培养,以GM-CSF诱导分化,第8天培养出未成熟BMDC,随机分为三组,其中LPS组应用LPS(1μg/ml)刺激BMDC成熟,ALX组同时应用不同浓度(2μM-500μM)的ALX进行干预,对照组不采取任何干预措施,于第10天收集细胞进行后续实验。2应用CCK8检测各ALX组、LPS组以及对照组BMDC增殖情况,将第10天收集的各组BMDC同BALB/c小鼠脾CD4+T细胞以1:5、1:10、1:20不同比例共培养2天,应用CCK8检测上述各组T细胞增殖程度。3应用流式细胞学检测各组BMDC表面MHC II,CD80,CD86平均荧光强度。4应用扫描电镜及透射电镜观察LPS组,ALX(2μM,10μM)组形态学特点。5应用ELISA方法检测LPS组,ALX(2μM,10μM)组细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-23含量。6应用Western Blot检测对照组,LPS组,ALX(2μM,10μM)组TBK1、p-TBK1(Ser172)、Akt、p-Akt(Ser473,Thr308)蛋白表达。7采用SPSS 23.0软件进行统计分析,实验所得数据进行正态性和方差齐性检验,以均数±标准误表示(Mean±SEM)。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA中Dunnet t检验进行方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.显微镜下观察GM-CSF诱导BMDC生长情况,第8天时可见细胞表面突起短而稀少,LPS再刺激2天后,即培养第10天可见细胞表面突起增多变长。2.应用CCK8检测,结果显示低浓度ALX(2μM-10μM)对BMDC增殖无明显抑制作用,而高浓度ALX(20μM-100μM)对BMDC增殖出现不同程度的抑制。3.应用CCK8检测,结果显示ALX(2μM,10μM)对BMDC诱导的同种异基因CD4+T细胞增殖具有抑制作用。4.应用流式细胞学检测,结果显示LPS增强BMDC表面MHC II,CD80,CD86平均荧光强度;ALX抑制LPS诱导的MHC II,CD86荧光表达,而对CD80无明显影响。5.应用ELISA检测,结果显示LPS刺激BMDC后IL-23、IL-12、IL-6分泌增加;ALX抑制IL-23、IL-12分泌,而对IL-6无明显作用。6.Western Blot检测,结果显示LPS促进p-TBK1和p-Akt蛋白表达,ALX进一步促进p-TBK1表达,而抑制p-Akt蛋白表达。第二部分氨来呫诺通过抑制Th1/Th17细胞及其炎症因子改善实验性自身免疫性脑脊髓炎病情目的:建立C57BL/6小鼠EAE模型,应用ALX进行灌胃干预,通过观察ALX组(用药干预组)和Vehicle组(EAE模型组)发病情况,体重变化,脊髓中炎性细胞浸润和脱髓鞘情况,检测两组小鼠脾及脊髓中Th1和Th17细胞及相应的特征性炎症因子、转录因子的变化,探讨ALX对EAE小鼠Th1和Th17细胞反应的影响。方法:1采用近交系雌性C57BL/6雌性小鼠作为实验动物,周龄8-10周,体重为18-20g。以MOG35-55为抗原,与完全弗氏佐剂和结核菌素混合乳化后予小鼠背部脊柱旁皮下注射,并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)两次腹腔注射500ng百日咳毒素(PTX),成功建立EAE模型。2将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、Vehicle组和ALX治疗组。自免疫当天开始,ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX(50mg/kg)灌胃,正常对照组及Vehicle组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX混悬液)进行灌胃。自免疫日开始,每日评价小鼠神经功能并称重,连续观察至缓解期,神经功能评分采用Knoz评分法。3应用HE染色观察脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况,并应用透射电镜及LFB染色观察脊髓髓鞘脱失程度。4应用流式细胞学检测各组小鼠脾中Th1和Th17细胞的比例。5应用ELISA方法检测血清及脾细胞培养上清中的炎症因子IL-17A、IFNγ含量。6应用q PCR方法检测小鼠脾组织及脊髓组织中炎症因子IL-17A、IFNγm RNA以及Th1和Th17细胞特异性转录因子T-bet、RORγt m RNA的转录水平。7应用Western Blot技术检测小鼠脊髓中IL-17和IFNγ的蛋白表达水平。8采用SPSS 23.0软件进行统计分析,实验所得数据进行正态性和方差齐性检验,以均数±标准误表示(Mean±SEM)。满足正态性前提下,方差齐时计量资料两均数的比较用t检验,方差不齐时计量资料两均数的比较用t’检验。方差不齐时用Mann–Whitney U检验。P<0.05有统计学意义。结果:1.ALX减轻EAE发病神经功能损害症状,推迟起病时间,并缓解EAE发病引起的体重下降情况。2.同Vehicle组相比,ALX干预后HE染色显示炎症细胞浸润程度轻,LFB染色及透射电镜显示髓鞘脱失程度轻。3.同Vehicle组相比,ALX干预后小鼠脾内Th1和Th17细胞比例下降,脾细胞培养上清及血清中炎症因子IFNγ和IL-17表达减少,脾中IFNγ、IL-17、T-bet、RORγt m RNA转录水平下降。4.同Vehicle组相比,ALX干预后脊髓内Th1和Th17细胞浸润减少,炎症因子IFNγ和IL-17表达下降,脊髓IFNγ、IL-17、T-bet、RORγt m RNA转录水平下降。第三部分氨来呫诺可能通过TBK1/Akt通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎脾中DC成熟目的:建立C57BL/6小鼠EAE模型,应用ALX进行灌胃干预,通过检测ALX组(用药干预组)和Vehicle组(EAE模型组)小鼠发病初期脾中DC成熟程度,TBK1/Akt通路的变化,探讨ALX对EAE小鼠脾DC成熟的影响及其可能的作用机制。方法:1采用近交系雌性C57BL/6小鼠作为实验动物,周龄8-10周,体重为18-20g。应用MOG35-55作为抗原,与完全弗氏佐剂和结核菌素混合后给予小鼠背部皮下注射,并于免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),建立EAE动物模型。2将免疫后雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、Vehicle组和ALX治疗组。自免疫当天开始,ALX治疗组小鼠给予每日两次ALX(50mg/kg)灌胃,正常对照组及Vehicle组小鼠每日同一时间以等量羧甲基纤维素钠(ALX溶剂)进行灌胃。在EAE发病初期(免疫后15天)对小鼠进行取材,以备后续实验。3应用流式细胞学技术检测EAE发病前期脾DC表面分子MHC II,共刺激分子CD80、CD86阳性率及平均荧光强度。4应用ELISA方法检测血清及脾细胞培养上清中的炎症因子IL-6、IL-12及IL-23含量。5应用免疫荧光检测方法观察脾DC中p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达。6采用SPSS 23.0软件进行统计分析,实验所得数据进行正态性和方差齐性检验,以均数±标准误表示(Mean±SEM)。满足正态性前提下,方差齐时计量资料两均数的比较用t检验,方差不齐时计量资料两均数的比较用t’检验。结果:1.流式细胞学方法检测结果显示,ALX组小鼠脾中CD80+CD11c+细胞比例较Vehicle组小鼠下降,两组相比有统计学差异,P<0.01;ALX组小鼠脾中CD86+CD11c+细胞比例较Vehicle组小鼠下降,两组相比有统计学差异,P<0.05;小鼠脾中MHC+CD11c+细胞比例同Vehicle组小鼠无明显统计学差异;ALX组小鼠脾中CD11c+细胞中CD80、CD86、MHC II平均荧光强度较Vehicle组均降低,差别有统计学意义,P<0.01。2.ELISA检测结果显示,ALX组小鼠血清中IL-12含量较Vehicle组降低,两组相比有统计学差异,P<0.001;ALX组小鼠血清中IL-23含量较Vehicle组降低,两组相比有统计学差异,P<0.01;ALX组小鼠血清中IL-6含量较Vehicle组无统计学差异。ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-12含量较Vehicle组降低,两组相比有统计学差异,P<0.01;ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-23含量较Vehicle组降低,两组相比有统计学差异,P<0.01;ALX组小鼠脾细胞培养上清中IL-6含量较Vehicle组无统计学差异。3.在发病初期对Vehicle组和ALX组进行免疫荧光染色,结果显示,同Vehicle组小鼠相比,ALX干预EAE小鼠后,脾DC中p-Akt(S473)及p-Akt(T308)荧光强度表达下降。结论:ALX可能通过抑制TBK1/Akt通路,干扰DC成熟,从而损害DC对Th1和Th17分化的诱导作用,进而缓解小鼠EAE发病。