论文部分内容阅读
阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73,ferulic acid esterase,FAE)能够水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间的酯键,释放阿魏酸。阿魏酸具有多种生理活性,如抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抑菌消炎等。此外,FAE还被广泛应用于食品、造纸、饲料等行业。传统的FAE筛选方法主要基于微生物的可培养技术,这种基于可培养微生物的研究方法,虽然能够筛选到FAE,但随着研究的深入和FAE发现数量的增加,一些已知的FAE被不断重复发现。而且,研究表明可培养微生物不到微生物总数的1%,高达99%的不可培养微生物才是微生物的研究主体,提示其中蕴藏着更加丰富的FAE。近年来,随着分子生物学及生物信息学的发展,出现了不依赖培养为基础的宏基因组学方法,该方法避开了传统微生物的分离培养问题,直接提取环境中的总DNA(eDNA),构建和筛选DNA文库得到目标单克隆,进行异源表达,获得目的产物。这种方法已经成为挖掘新型FAE的有效手段。本研究利用功能筛选法从土壤宏基因组文库中筛选FAE单克隆,通过ORF Finder定位编码FAE的基因序列,对该序列进行生物信息学分析,利用大肠杆菌对FAE进行异源表达,FAE经纯化后进行酶学性质表征。1.以FAE活性为指标,利用功能筛选法筛选具有活性的单克隆。通过ORF Finder定位编码FAE的基因序列,命名为fae-xuan,相应的编码蛋白命名为FAE-Xuan。BLASTp比对结果表明FAE-Xuan与已知FAE的最高相似度为49%,提示其可能编码一种新的FAE。多序列比对结果显示FAE-Xuan具有一个保守的五肽基序G-X-S-X-G,S84位于五肽基序中,并与D203和H224共同构成了该酶的催化三联体。系统发育树分析结果表明FAE-Xuan属于A型FAE家族。利用SWISS-MODEL对FAE-Xuan的三级结构进行预测,结果发现其具有一个典型的α/β水解酶折叠构造,主要由帽子结构域和催化结构域组成。2.FAE单克隆的异源表达。将fae-xuan酶切酶连至pET28a表达载体中,形成重组质粒pET28a-fae-xuan,并将此重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。利用镍柱亲和层析技术对含有His标签的重组酶进行纯化,纯化后的重组酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测后发现其分子量大小为29kDa,与预测值基本一致,且仅有1条电泳带,表明获得了纯的FAE。3.FAE酶学性质表征。通过优化实验,确定酶发挥作用的最适条件,包括反应温度、pH值等;以四种羟基肉桂酸甲酯为底物确定该酶的底物特异性,并测定酶反应的相关动力学常数;验证不同金属离子和化学溶剂对酶活性的影响。实验结果表明FAE-Xuan的最适温度为30℃,最适pH为5.0,表明其是一个酸性FAE。该酶在pH 3.0-10.0范围内孵育4h后,残余酶活仍保持在70%以上,表明其具有较强的pH稳定性。底物特异性实验表明FAE-Xuan对阿魏酸甲酯的催化活性最高(40 U/mg)。Ba2+、Zn2+、Cu2+、异丙醇和二甲基甲酰胺(DMF)对FAE-Xuan酶活有显著抑制作用,K+、Na+和Mg2+对酶活有一定促进作用,其余的金属离子及化学试剂对FAE-Xuan影响不大。FAE-Xuan能够水解DSWB并释放阿魏酸,且与木聚糖酶协同作用时,阿魏酸释放量增加更为显著。本研究中的FAE-Xuan在pH 3.0-10.0范围内具有较强的pH稳定性,这种宽pH范围的FAE在已有报道中较为少见。FAE-Xuan的这些良好性质使其可作为一种颇有潜力的候选酶,具有潜在的工业化应用价值,而且,该研究结果进一步证实利用宏基因组学技术是挖掘和发现新酶的一种强有力工具。