血栓调节蛋白（Thrombomodulin,TM）是定位在细胞膜上的一种跨膜糖蛋白,正常情况在血浆中的含量很低。当血管内皮细胞受到损伤,TM会裂解释放到血浆中。研究表明,检测血浆中的TM含量可以评估细胞损伤程度,辅助诊断癌症、血栓和心脑血管类疾病。但是如何实现TM的精准定量检测仍是目前研究的难点所在,技术的壁垒在于表达纯化高纯度抗原,制备抗体后筛选到识别活性结构的配对抗体,建立相应的检测方法。目前市场上检测TM普遍使用酶联免疫吸附测定（ELISA）和化学发光免疫分析（CLIA）两种方法,但是ELISA检测试剂良莠不齐,缺乏统一的标准,临床应用价值低。CLIA法以其高灵敏度、宽线性范围、重复性好等优势成为体外诊断的新趋势,其中日本希森美康（Sysmex）公司的TM化学发光检测试剂盒占据了国内外绝大部分市场。为打破跨国公司的技术垄断,助力实现进口试剂盒的国产化替代进程。本研究利用HEK293表达制备TM重组蛋白,免疫小鼠获取抗体。同时基于双抗体夹心建立CLIA法检测TM,对反应体系进行优化,确定操作流程。然后评估该方法的各项分析性能指标,最后建立参考范围,进行临床血浆样本比对。本文主要研究结果如下:（1）制备重组蛋白TM-h Fc和鉴定活性成功构建含TM胞外域和人源Ig G1中Fc序列的表达质粒pc DNA3.4-TM-h Fc。将该质粒转染到HEK293细胞中时,发现使用lipo 3000转染试剂可以获得最高的蛋白表达量,其与质粒的最优比例为3:1（μL:μg）。经SDS-PAGE鉴定TM-h Fc纯度在90%以上。以TM-h Fc作为抗原免疫小鼠,共获得4株单克隆抗体。（2）研究优化检测条件和反应体系测试后NUNC公司的化学发光微孔板性能最好,使用5μg·m L-1生物素化BSA与12μg·m L-1链霉亲和素包被96微孔板（简称SAC板）。TM抗原稀释基质(g·L-1):2-氯乙酰胺10.0、BSA 4.0、γ-球蛋白2.0、吐温1:5000、小鼠血清1:1000,0.2 mol·L-1磷酸缓冲液,p H=7.5。对4株单克隆抗体进行配对筛选,结果表明TM2作为生物素化抗体、TM3作为酶标抗体具有更强的分辨能力,工作浓度分别为0.5μg·m L-1和0.75μg·m L-1。加样后的孵育时间选为15 min,清洗5次,底物A、B中主要成分鲁米诺和硼砂的浓度分别为4 g·L-1和0.6 g·L-1,在底物加入2 min时进行检测。（3）检测方法中校准品的溯源按照技术要求将本方法与Sysmex公司TM化学发光检测方法进行溯源。通过标定程序完成对工作校准品的赋值,再以同样的方法完成产品校准品的赋值,最后对常规血浆样本进行检测,溯源过程的总不确定度低于10%,说明溯源过程高度可信。（4）评估检测方法的各项性能指标最低检测限为0.2 TU·m L-1,回收率在100±15%以内,线性范围为1～200 TU·m L-1,批次内、批次间变异系数均在8%以下,重复性较好。在血浆中加入定量的胆红素、血红蛋白和甘油三酯,对检测结果无干扰作用,与血浆中TAT、PIC、t PAI-C和D-二聚体无交叉反应。确定TM检测试剂在37℃条件下可保持10天性能稳定。本检测方法在样本浓度0～294.15 TU·m L-1时,未出现HOOK效应。（5）临床实验的开展和参考范围的确立人体内TM正常参考范围为3.8～13.3 TU·m L-1,本试剂与Sysmex公司TM试剂盒同时检测267例临床血浆样本,结果表明两种试剂的相关系数大于0.97,一致性好,符合率高,两种方法的检测结果具有等同性。综上所述,本研究建立的TM微孔板化学发光法可定量检测人血浆中TM含量,该方法检出限,准确度,精密度和稳定性等满足临床要求,可替代国外试剂。