论文部分内容阅读
聚羟基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)],是一种微生物合成的天然高分子生物材料。它作为聚羟基脂肪酸酯(PHA)的一员,除具有PHA大类共有的生物相容性良好和可降解性外,还拥有出色的弹性和透明度。在本研究中,通过引入了来源于Ralstonia eutropha的β-酮硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)、Pseudomonas fluorescens strain2P24来源的PHA合成酶突变体(PhaCm)以及来源于Clostridium propionicum的丙酸CoA转移酶突变体(Pctth),在大肠杆菌中建立聚羟基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]的异源合成途径,实现利用葡萄糖一步法合成P(3HB-co-LA)。 在成功合成P(3HB-co-LA)的基础上,通过敲除辅酶Q8生产过程中的黄素异戊烯基转移酶基因(ubiX),以降低呼吸链强度从而增强乳酸供给;并敲除D-乳酸脱氢酶基因(dld),以减少乳酸在发酵后期转化成丙酮酸。上述策略将聚合物中乳酸组分的摩尔百分比提高到15.0%。进一步通过启动子工程对关键酶Pctth的表达进行优化调控,当表达Pctth的启动子分别替换为组成型的ldhA启动子和IPTG诱导的trc启动子后,聚羟基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]中乳酸组分的摩尔百分比提高到19.5%。 最后,使用木糖和甘油作为葡萄糖的替代碳源,分别在M9培养基和LB培养基中对本研究构建的9种重组菌生产P(3HB-co-LA)的能力进行了考察。实验结果表明,与葡萄糖相比,以木糖为碳源生产的聚合物P(3HB-co-LA)中乳酸的摩尔百分比更高。而以甘油为碳源时,多数情况下生产出的聚合物为均聚物PHB,不含乳酸组分,即甘油不是生产聚合物P(3HB-co-LA)的理想碳源。经过一系列优化,最终生产的聚合物P(3HB-co-LA)中乳酸组分的摩尔百分比最高可达28.9%。