研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是工业上用途广泛的有机溶剂,也是粘胶纤维、农药、橡胶、玻璃纸等的生产原料。生产过程中,CS2易挥发扩散到生产环境中,对工人健康产生危害。我国是纺织品生产大国,粘胶纤维的产量呈高速增长,并且该产业从业人数众多,其中长丝和短丝等纺丝工艺以女工接触为主。研究发现,CS2对心血管、神经、肝脏、肾脏、内分泌系统等均有毒性作用。另外,对CS2生殖毒性的研究发现,CS2可导致男性工作者精子数量减少、畸形率增加、睾丸萎缩、性功能减退等,并可导致女工性腺机能障碍,流产和子代出生缺陷等。本课题组以CS2作业女工为观察对象的前瞻性研究结果发现,CS2作业女工受孕时间比对照人群明显延长,并且其早早孕丢失率明显高于对照人群,提示CS2干扰胚胎着床。课题组采用动物实验研究进一步发现,植入期暴露于CS2致使小鼠的胚胎植入数目明显减少,但其胚胎毒性的作用机制尚未阐明。近年来生殖过程中的调控通路研究成为关注方向,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞生长中处于核心地位,参与基因转录、蛋白质翻译、细胞自噬等多种生物活动；且有研究发现mTOR信号通路在胚胎植入过程中发挥重要的调控作用,外源性化学物可通过mTOR通路干扰胚胎正常植入。此外,整合素β3及白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)可作为mTOR通路的上游调控因子,参与调节mTOR的表达。因此,本研究假设植入期暴露于CS2后可通过mTOR及其上游调节因子的异常表达可导致胚胎植入障碍。本研究拟采用小鼠动物模型,在胚胎植入时期的不同时段暴露于CS2,于暴露后不同时间终止实验以检测孕鼠子宫组织mTOR、整合素p3以及LIF的表达水平,探讨mTOR及相关调节蛋白在CS2致胚胎植入障碍中的毒性作用机制。研究目的构建胚胎植入期不同时间点暴露于CS2致小鼠胚胎植入障碍的动物模型,观察不同时点CS2暴露对孕鼠母体及胚胎的毒作用,检测不同暴露时间不同观察终点孕鼠子宫组织中mTOR、整合素p3以及LIF的表达水平,探讨mTOR及相关调节蛋白(整合素β3以及LIF)在CS2所致胚胎植入障碍中的作用,进一步揭示CS2暴露致胚胎植入障碍机制,为预防和控制CS2作业女工生殖损伤提供科学依据。研究方法1.实验设计本实验分为三部分：第一部分建立暴露于CS2后的胚胎植入障碍时间依赖动物模型,观察植入期不同时间点暴露于CS2后的母体毒性和胚胎毒性,并且观察胚胎植入障碍的敏感暴露时点。第二部分,孕鼠在植入期不同时间点暴露于CS2并且在不同时点终止实验,收集孕鼠子宫组织检测其中mTOR的蛋白及mRNA表达水平,分析并探讨mTOR在CS2致胚胎植入障碍中的作用机制。第三部分的动物处理及分组同第二部分,检测孕鼠子宫组织中整合素p3以及LIF蛋白及mRNA表达水平,并探讨mTOR、整合素β3以及LIF三者的关系在CS2致胚胎植入障碍中的作用机制。2.染毒时间及方式本实验第一、二、三部分动物的染毒时间点相同,设4个染毒时间点,分别于胚胎植入期第3天(3th gestational day, GD3)、第4天(GD4)、第5天(GD5)和第6天(GD6)。实验期间每组孕鼠仅给予一次染毒,各组孕鼠于染毒时间点接受腹腔注射一次CS2或者溶剂(CS2暴露剂量为631.4 mg/kg;溶剂对照为橄榄油；注射容量为O.1ml/10g体重)。3.实验分组及观察终点实验分组：根据4个染毒时间分为定义1组至4组,即1组为GD3染毒、2组GD4染毒、3组GD5染毒、4组GD6染毒。观察终点：第一部分四组的观察终点均为GD9,用于观察母体毒性及胚胎毒性,记录胚胎植入数目。第二、三部分四组的观察终点分别为：1组(GD3染毒)为GD4、GD5、GD6、GD7;2组(GD4染毒)为GD5、GD6、GD7,3组(GD5染毒)为GD6、GD7; 4组(GD6染毒)为GD7,每一部分均包括10个观察终点,用于样本收集以检测子宫组织mTOR、整合素β3以及LIF蛋白及mRNA的表达水平。3.动物受孕及分组SPF级性成熟昆明种小鼠适应性喂养一周,按照雌雄比1：1合笼,次日晨8点检查阴栓,阴栓阳性记为孕1天(即GD1),并将其随机分到各个观察终点。每个观察终点含12只孕鼠,随机分配6只接受CS2暴露,另6只为溶剂对照。4.样本收集及子宫组织mTOR、整合素113以及LIF表达水平的测定第一部分中,四组孕鼠在GD9观察终点经脱臼处死,称取子宫、卵巢、肝、脾、肾、胚胎的重量,并记录胚胎植入的数目；第二、三部分,收集四组10个观察终点的孕鼠子宫组织,于-80℃冰箱保存备用,其中一半组织进行匀浆后取上清液用于蛋白测定,另一半组织用于mRNA测定。运用免疫组织化学(Immunohistochmeistry, IHC)和酶联免疫吸附测定法(enzymes linked immunosorbent assay, ELISA)测定孕鼠子宫组织中mTOR蛋白含量；运用实时荧光PCR测定孕鼠子宫组织中mTOR的mRNA含量。运用BCA蛋白浓度测定法测定孕鼠子宫组织匀浆液蛋白浓度；运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(western blotting)法测定孕鼠子宫组织中整合素β3以及LIF蛋白表达含量；运用实时荧光PCR测定孕鼠子宫组织中整合素β3以及LIF的mRNA含量。5.统计学分析采用Excel建立数据库,运用SPSS 20.0进行统计分析,服从正态分布的测量指标均以x±s表示。各组指标首先进行方差齐性检验,若方差齐,采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行F检验,差异有显著性时采用Dunnett-t test比较各暴露组与对照组均数之间的差异；若方差不齐,采用非参数统计Kruskal-Wallis H法进行组间比较。统计学检验水准设定为α=0.05。研究结果1.围植入期CS2暴露致孕鼠母体毒性及胚胎毒性母体毒性：①在胚胎植入期的不同时点暴露于CS2后,暴露组GD9的孕鼠体重和净体重增量与对照组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②暴露组GD9孕鼠的子宫、卵巢、肝脏、脾脏以及肾脏的脏器系数与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。胚胎毒性：①在胚胎植入期的不同时点暴露于CS2后,GD3、GD4、GD5和GD6暴露组的胚胎植入数均低于对照组(P<0.05),其中GD4暴露组的胚胎植入数目减少最为明显。各暴露组的胚胎植入数较对照组分别减少了36.89%、57.58%、33.79%和36.55%。②各暴露组的胚胎窝重与对照比相比,差异均有统计学意义(P<0.05),但校正胚胎植入数之后的胚胎均重与对照比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.围植入期CS2暴露对孕鼠子宫组织mTOR蛋白及mRNA表达水平的影响胚胎植入期不同时点暴露于CS2后,GD3暴露组的GD4、GD5和GD6观察终点,GD4暴露组的GD5、GD6和GD7观察终点,GD5暴露组的GD6和GD7观察终点,孕鼠子宫组织mTOR蛋白表达水平较对照组均有降低。其中,GD3暴露组的GD5观察终点孕鼠子宫组织mTOR较对照组下降了37.32%(P<0.01)；GD4暴露组的GD5观察终点孕鼠子宫组织mTOR蛋白下降最为明显,较对照组下降了56.42% (P<0.01)；GD7观察终点较对照组下降了45.22%(P<0.01)。mRNA结果显示,胚胎植入期不同时点暴露于CS2后,GD3暴露组的GD4、GD5、GD6和GD7观察终点,GD4暴露组的GD5和GD6观察终点,GD5暴露组的GD6观察终点,孕鼠子宫组织mTOR的mRNA表达水平较对照组均有降低。其中,GD3暴露组的GD5观察终点孕鼠子宫组织mTOR的mRNA水平较对照组下降了62%(P<0.01)；GD4暴露组的GD5终点孕鼠子宫组织mTOR的mRNA水平较对照组下降了55%(P<0.01)。3.围植入期CSz暴露对孕鼠子宫组织整合素β3和LIF的蛋白及mRNA表达水平的影响在胚胎植入期的不同时点暴露于CS2后,各个暴露组孕鼠子宫组织整合素β3和LIF蛋白水平较对照组均有降低。GD3暴露组的GD4、GD5、GD7观察终点整合素β3的蛋白较对照组下降了44%、43%、30%(P<0.05)；GD4暴露组的GD5、GD7观察终点整合素p3分别较对照组下降了29%、35%(P<0.05)；GD5暴露组的GD7观察终点整合素β3较对照组下降了36%(P<0.01)；GD6暴露组的GD7观察终点整合素β3较对照组下降了27%(P<0.05)。GD3暴露组的GD4、GD5、GD6观察终点LIF的蛋白较对照组下降了43.8%、48.7%、24.2%(P<0.05)；GD4暴露组的GD5观察终点LIF较对照组下降了54.3%(P<0.05)；GD5暴露组的GD6观察终点LIF较对照组下降了38.7%(P<0.05)；GD6暴露组的GD7观察终点LIF较对照组下降了22.6%(P<0.05)。mRNA结果显示,胚胎植入期的不同时点暴露于CS2后,各个暴露组孕鼠子宫组织整合素β3和LIF mRNA水平均有所降低。GD3暴露组的GD4、GD5、GD7观察终点整合素β3的mRNA较对照组下降了72%、70%、80%(P<0.01)；GD4暴露组的GD5、GD7观察终点整合素β3分别较对照组下降了88%、71%(P<0.01)；GD5暴露组的GD7观察终点整合素β3较对照组下降了76%(P<0.05)：GD6暴露组的GD7观察终点整合素β3较对照组下降了47%(P<0.05)。GD3暴露组的GD4、GD5、GD6观察终点LIF的mRNA较对照组下降了45.8%、30.8%、28.4%(P<0.05)；GD4暴露组的GD5、GD6观察终点整合素β3分别较对照组下降了45.9%、50%(P<0.01)；GD5暴露组的GD6观察终点整合素β3较对照组下降了25.8%(P<0.05)；GD6暴露组的GD7观察终点整合素β3较对照组下降了20.1%(P<0.05)。结论1.围植入期暴露于CS2未显示明显的母体毒性,但可导致明显的胚胎毒性,即胚胎数目的减少,并且在GD4暴露时胚胎丢失最为明显。提示GD4暴露是CS2致胚胎植入障碍的敏感时间点。2.围植入期暴露于CS2可导致孕鼠子宫组织mTOR蛋白及mRNA表达水平下降,并且在GD4暴露后的第一个观察终点最为明显,提示mTOR表达水平的降低可能是CS2致胚胎植入障碍的机制之一。3.围植入期暴露于CS2可孕鼠子宫组织整合素p3和LIF蛋白及mRNA表达水平下降,且植入期二者表达水平的变化趋势与mTOR一致,提示整合素β3、LIF、mTOR三者可能协同参与CS2致胚胎植入障碍的机制,但其具体作用机制仍需进一步研究验证。