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哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性的海洋细菌,广泛分布于海洋环境及海洋生物,能引起海水鱼类及其它养殖动物发病,是世界上许多国家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌,也是我国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外蛋白酶、磷酯酶、溶血素、Ⅲ型分泌系统、密度感应系统等与其致病性密切相关。目前国内对细菌病防治仍然主要靠化学药物及抗生素,由此带来的环境污染、药物残留及细菌耐药性现象日益明显。疫苗防治方法由于安全无污染,是未来疾病防治的首选措施。微生物常遇到环境中较多的活性氧自由基的损害。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH,是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统,广泛地存在于真核生物和原核生物中。硫氧还蛋白系统与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长密切相关。其中,硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶。主要功能是催化NADPH将小分子蛋白硫氧还蛋白上的二硫键(-S-S)还原成(-SH)2的反应,维持Trx的还原型,可以维持细胞自由基产生和清除之间的平衡,在微生物适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。本文从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶基因的1133 bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple,测序结果表明,目的片段含有960 bp的硫氧还蛋白还原酶基因阅读框,编码319个氨基酸残基的蛋白质。BLAST分析显示氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列相似性为分别为99%、98%、96%、94%、92%,该基因被命名为trxR。构建表达质粒pET-28a(+)/trxR后转化至大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子量为34 kDa。用Ni琼脂糖亲和柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆,直接ELISA法检测了1-4周特异性抗体的效价。结果表明,1-4周内特异性抗体效价持续升高,达到log27.0。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1进行人工感染,对照组的死亡率为100%,免疫组的死亡率为25%,免疫保护率为75%。表明哈维氏弧菌TrxR蛋白具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。