研究意义 脑血管病发病的主要病理生理特征是脑老化与缺血形成的复合损伤；以往多用单一脑老化或缺血模型孤立开展脑血管病的发病机理研究，流行病学调查显示脑血管病多发生在老年人，因此，脑损伤实验模型不应忽视脑老化是脑缺血发生基础这一根本病因学特征。人在老年前期(45-59岁)即出现记忆力下降等脑老化现象，而多发脑梗塞性痴呆以及其它类型的脑血管病多发生在60岁以上的老年人，提示脑老化是脑血管病发病的基础，因此，揭示脑老化与脑缺血复合伤的发病机理是本研究的主要目的之一，也是指导实验治疗评价的前提和基础。 垂体腺苷酸环化酶激活肽(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是一种具有广泛生物活性的神经多肽，参与调节细胞生长、发育、增殖与分化等多种生理活动，具有高效神经保护作用，是有发展前景的脑老化和缺血复合损伤侯选药。目前，已有少数文献报道了PACAP防治大鼠脑缺血损伤效应，但对脑老化基础上缺血保护作用的机理研究甚少。 本研究旨在从分子和细胞水平揭示脑老化和缺血复合伤最常见的病理生理改变—神经元凋亡的特征和发生机制，并观察PACAP抗脑老化和缺血双重损伤的效应和机理，以及分子和细胞水平的变化与神经环路(海马LTP)功能改变的关系，为寻找新的脑血管病防治药提供实验依据。博士学位论文 中文摘要 第一部分 脑老化与缺血复合伤神经无凋亡机理及一PACAP抗凋亡效应 观察老年大鼠全脑缺血后再灌注不同时间神经元凋亡和氧化损伤的变化规律，及分析PACAP的作用机制。 采用四血管结扎法，建立老年大鼠全脑缺血模型，于缺血 10min后再灌注6h、id、3d、sd和7d计数HE染色的海马CAI区锥体神经元存活数和皮层缺血样改变的神经元数，TUN－EL法计数凋亡神经元，电镜观察海马CAI区超微结构变化，并测定脑组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧物酶（SOD）和谷联甘肽过氧化物酶（GSH－PX）活性。在海马CAI区和皮层神经元采用免疫组化SABC法观察CasPase〕和TeA表达的变化。同时观察侧脑室注射PACAP对老年大鼠缺血再灌注3d上述参数的影响。 结果显示，老年大鼠全脑缺血再灌注3d海马CAI区和皮层神经元凋亡数达到高峰，存活神经元数显著减少，电镜显示海马CAI区神经元呈现染色质边集、核不规则因缩等凋亡改变。脑组织 SOD和 GSHIX活性明显降低，MDA含量升高，再灌注3d较明显。神经元CasPase〕蛋白表达增加，与神经元凋亡里时间依赖性。再灌注期TrKA表达也增加，提示可能与神经元内源性保护机制有关。注射PAC AP后脑组织MDA含量明显下降，SOD和 GSH－PX活性显著上升，海马 CAI区存活神经元数增加，凋亡神经元数减少，并且皮层缺血样和凋亡神经元数减少，与未注射组均有明显差异，表明PACAP具有抗氧化、减轻凋亡损伤、促进神经元存活和保护超微结构等作用。PACAP抑制海马和皮层 Caspase上表达，增加再灌注 id皮层神经元 TrKA的表达，提示PACAP可能通过扩大神经元对NGF的反映而起到保护作用。 6博士学位论文 中文摘要 第二部分 活性氧致海马神经细胞损伤及协＊＊P的保护机制 通过高体实验进一步观察脑老化和缺血的共同致病因子．活性氧 （Reactive oxygen spedes，ROs）对神经兀的损伤及 PACAP抗神经元凋亡的机理。 原代培养海马神经元，通过次黄瞟吟（Hrpothine，HX）和黄瞟吟氧化酶（Xanthine oxidase，XO）反应，建立 ROS氧应激损伤体外模型。MTT法测定细胞存活率，同时观察神经元的生长状况，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪测定线粒体膜电位（Mitochondrion membranepotential，MMP），RTPCR法观察 Caspase－3 InRNA和 PACAP型受体 （PAC－R）InRNA表达的变化。 结果显示、随HX／XO浓度的增加，细胞存活率明显减低，海马神经元损伤加重，神经元突起断裂甚至消失。pACAp门”‘，10““，10”“M）可显著提高神经元存活率，并增加神经元突起长度和突起数目。经ROS处理后海马神经元内红色荧光减弱，绿色荧光明显增加，说明ROS诱导了MND减低，线粒体功能下降。预给予PACAP则具有改善作用，并呈一定的剂量效应。RTpCR结果显示，ROS可致 C旺p”合3 dA表达增加，而PACAI，可明显降低Caspase〕 InRNA的表达，提示PACAP可能通过抑制Caspase上的表达而抑制神经元凋亡。给予不同浓度的PACAP，其受体 PACI．R mltNA表达明显增加，呈现明显的量效关系，提示 PACK可能参与了 PACAP的抗神经元凋亡效应。 第三部分 脑老化和缺血神经元突触传递与递质受体的变化及PACAP的干预效应 通过诱导长时程增强电位（Longterm potentiation，LTPL分别观察