金黄色葡萄球菌是医学上重要的致病菌,在医院环境中分布广泛,且致病力强,可以引起皮肤粘膜及软组织的脓肿、中耳炎、关节炎、肺炎等临床常见的感染,还可以引起骨髓炎、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等严重感染。该菌对环境因素有很强的适应能力,很容易获得对抗生素的耐药性和对消毒剂的抗性,因此能够在医院环境中长期生存,是医院感染最常见的病原菌之一。近年来,随着抗生素的大量使用,金黄色葡萄球菌的耐药问题日益突出,对人类生命健康造成重大危害,因此,引起医学界和政府部门的广泛重视。金黄色葡萄球菌耐药性的主要特点是:(1)医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)分离率越来越高,呈多重耐药特性;(2)MRSA从医院感染向社区感染蔓延,且致病性显著增强,感染的人群也从住院患者,播散到健康儿童和成人;(3)对万古霉素敏感性减低的金黄色葡萄球菌(SA-RVS)出现,使感染患者的治疗失败率和死亡率显著增加。本研究旨在通过对临床分离的金黄色葡萄球菌耐药表型、耐药基因和分子遗传学特征进行检测,以深入了解、分析MRSA和SA-RVS的流行情况、耐药特征、耐药机制、遗传学背景及传播方式,研究结果将为临床合理使用抗生素、制定有效的预防控制措施提供依据。主要研究内容包括以下四个部分:第一部分:金黄色葡萄球菌耐药表型与耐药基因相关性分析目的:了解合肥地区某三甲医院金黄色葡萄球菌的耐药特征,分析耐药基因与耐药表型的关系,探讨耐药机制。方法:采用Vitek微生物分析仪检测金黄色葡萄球菌对不同种类抗生素的敏感性;采用PCR方法检测mecA、aac(6’)/ aph(2’’)、aph(3’)-III、ermA/ermC、tetM/tetK等耐药基因,并采用多重PCR方法对141株MRSA进行SCCmec基因分型。结果:(1)住院患者标本中分离的金葡菌对青霉素、头孢唑啉、克林霉素、红霉素、苯唑西林、庆大霉素、四环素、复方磺胺和左氧氟沙星的耐药率显著高于门诊患者(P﹤0.05)。住院患者中,2004年、2005年和2006年MRSA的分离率分别为40.4℅、73.6℅、69.4℅,有增加趋势;其中有83.9%的MRSA表现为对3类以上抗生素耐药(多重耐药)。(2) mecA基因检测与青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢唑啉耐药性的符合率分别为:64.71%,64.22%,94.11%和99.50%;阳性预测值分别为100%、100%、99.60%和93.36%;阴性预测值分别为:6.41%, 7.69%,95.51%,99.36%。ermA/ermC检测与红霉素、克林霉素耐药性的符合率为:88.24%和89.22%,阳性预测值为98.60%和91.58%,阴性预测值为64.23%和83.74%。tetM/tetK联合检测与四环素耐药的符合率为77.45%,阳性预测值为96.59%,阴性预测值为62.39%。(6’)/ aph(2’’)和aph(3’)-III联合检测与庆大霉素耐药的符合率为77.21%,阳性预测值为95.83%,阴性预测值为64.17%。(3)合肥地区分离的141株MRSA中,SCCmecⅡ型34株(24.1%),Ⅲ型102株(72.3%),IV型5株(3.5%),药敏结果显示,SCCmecIV型MRSA仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药,而Ⅱ、Ⅲ型MRSA为多重耐药菌株,但Ⅲ型菌株耐药率高于Ⅱ型。结论:(1)住院患者感染的金黄色葡萄球菌耐药率高,应尽早进行细菌培养并根据药敏实验结果选择使用抗生素。门诊皮肤软组织感染标本中分离的金葡菌对苯唑西林、头孢唑啉、左氧氟沙星、庆大霉素、复方磺胺等抗生素耐药率较低,可以选择这些抗生素进行经验治疗。(2)本文所检测的几种耐药基因与细菌耐药表型均有较高的符合率(>60%),表明mecA编码的PBP2a;ermA/ermC编码的红霉素甲基化酶; aac(6’)/ aph(2’’)、aph(3’)-III编码的氨基糖苷乙酰转移酶;以及tetM/tetK编码的四环素外排泵系统以及核糖体保护蛋白是金黄色葡萄球菌对相关抗生素耐药的主要机制;耐药基因检测阳性预测值较高(均>90%),提示携带耐药基因的细菌可表达为耐药;而阴性预测值较低,提示在主要耐药机制以外,还存在有其他耐药机制。(3)MRSA菌株的多重耐药性与SCCmec基因盒的结构与分子量相关。SCCmecⅢ型基因盒结构最为复杂,分子量最大,耐药率也最高。相反,SCCmecIV型结构简单,分子量小,仅表现为对β-内酰胺类抗菌药物耐药。第二部分:MRSA快速检验方法的建立和应用评价目的:建立一种快速检测MRSA的方法,评价该方法的敏感性和特异性。方法:采用免疫磁珠富集细菌,使用多重PCR同时检测金黄色葡萄球菌的种属特异性基因和β-内酰胺类抗生素耐药基因,建立一种MRSA快速检测方法,并将该方法与其它几种快速检测方法比较,评价其临床应用情况。结果:免疫磁珠-多重PCR方法与金标准方法相比,敏感性高(100%),特异性强(96.8%);检测时间明显缩短,为6～8h;但检测成本较高。结论:免疫磁珠捕获-多重PCR是一种快速、敏感、特异的方法。缺点是检测成本较高。第三部分:SA-RVS检测方法及耐药机制目的:了解合肥地区某三甲医院SA-RVS检出率,探讨耐药机制,了解细菌耐药变异对常规细菌鉴定和药敏试验结果的影响。方法:采用含4μg/ml万古霉素的脑心浸液琼脂对331株金黄色葡萄球菌进行筛选,采用群谱分析法对筛选阳性菌株进行确认。采用体外诱导试验将1株异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(h-VRSA)菌株诱导成为不同程度的万古霉素耐药菌株;使用几种细菌鉴定和药敏试验方法对临床分离的h-VRSA菌株和系列诱导菌株进行检测,比较检测结果。结果:在331株金黄色葡萄球菌中,共检出14株h-VRSA(4.23%)。h-VRSA在光学显微镜下表现为细菌大小不等,染色不均;扫描电镜显示细菌表面粗糙不平,有结节状凸起;透射电镜见细胞壁显著增厚。细菌在血平板上生长的菌落较小、溶血环变窄或消失、色素减弱或消失;血浆凝固酶、甘露醇等试验结果由阳性变为阴性。用常规方法进行细菌鉴定,14株h-VRSA中有11株被错误地鉴定为溶血葡萄球菌。用纸片扩散法和Vitek32微生物分析仪方法检测万古霉素的敏感性,h-VRSA、VISA和VRSA均被误判为“敏感”,存在“重大错误”。结论:合肥地区已出现h-VRSA菌株,h-VRSA对万古霉素耐药机制与细胞壁增厚有关;同时h-VRSA细胞壁改变可引起细菌生物学特性改变,继而会导致常规细菌鉴定和药敏试验结果的错误,需引起临床的重视。第四部分:MRSA、h-VRSA感染危险因素及分子流行病学特征目的:探讨MRSA、h-VRSA感染危险因素及分子流行病学背景,为制定有效的预防控制措施奠定理论基础。方法:对MRSA和h-VRSA菌株的临床资料进行回顾性统计分析,了解感染危险因素;对95株金黄色葡萄球菌(包括MSSA、MRSA、h-VRSA)进行MLST分型,了解菌株的遗传学背景及进化路线;对31株ICU监测菌株采用随机引物PCR进行扩增分析,了解菌株的同源性。结果:(1)在373例金黄色葡萄球菌感染患者中,老年患者的MRSA分离率(85.5%)明显高于儿童(16.3%);在各类标本中,痰标本与脓标本中MRSA分离率较高,分别为88.1%和68.3%;在不同科室中,ICU的MRSA分离率最高,为90.9%;MRSA感染主要危险因素有:侵袭性治疗、长期住院、长期联合使用抗生素等。(2)ICU细菌学监测结果显示:从28位医护人员及患者采集的79份标本中,有24份分离出MRSA(30.4%);从环境采集的52份标本中,有7份检出MRSA(13.5%);从空气采集的15份标本中未检出MRSA。对所有分离的31株MRSA用RAPD技术进行基因分型,其中有20株(64.5%)属于同一型别。(3) MLST分型显示,MSSA与MRSA流行的基因型别不同;而h-VRSA的主要基因型与MRSA相同。在62株MRSA中,主要是ST239-MRSA-III型(43.5%)和ST5-MRSA-II型(30.6%)两个基因型占优势;在13株h-VRSA中,主要为ST239-MRSA-III型(53.8%)占优势。结论:(1)应加强对老年人及具有感染危险因素患者的MRSA监测,及时发现感染和带菌者;(2)在ICU中,存在医护人员、患者和环境之间MRSA克隆株的相互传播。(3)住院患者的MRSA感染主要来源是MRSA流行株的医院感染,而不是MSSA。h-VRSA来源于医院感染的MRSA,可能是MRSA在抗生素选择性压力下产生的。