Aurora是保守的丝氨酸／苏氨酸激酶家族之一,在有丝分裂过程中调控染色体分离和胞质分裂等事件。Aurora家族的三个成员(Aurora A/B/C)在多种肿瘤组织中过量表达,在有丝过程中均起到非常重要的作用。Aurora激酶已成为靶向性抗肿瘤药物研发的一个热点靶点。目前有很多以Aurora激酶为靶点的抑制剂已进经入临床实验研究阶段。我们实验室于2006年表达了高纯度有活性的Aurora B激酶,并以它为靶点建立了高效可靠的高通量筛选模型,从国家新药筛选中心的70,000个小分子化合物中筛选到了数十个阳性化合物。我们从中选取阳性化合物S2做进一步药效药理的研究。激酶选择性实验发现,S2在体外不仅抑制Aurora B和Aurora A激酶活性,同时还抑制VEGFR/PDGFR激酶活性,表现出极大的多靶点激酶抑制剂药物的潜力。在此基础上,我们首先使用基于Kinase-Glo发光激酶检测法的Aurora B高通量筛选模型将化合物S2、其顺式异构体S2-Z及VX680对体外Aurora B激酶活性的抑制能力做了比较,发现S2的抑制能力与VX680相当,且显著高于S2-Z。进一步检测了化合物S2与VX680、ZM447439对多种肿瘤细胞系生长抑制的IC50值,发现S2对不同组织来源的细胞系包括肝癌、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、宫颈癌等显示出不同程度的生长抑制,其中在肝癌中S2的抑制能力要高于VX680和ZM447439,在结肠癌中也表现出与VX680和ZM447439效果相当的抑制作用。利用流式细胞仪检测到化合物处理的细胞出现显著的G2/M期阻断和细胞凋亡；利用化合物处理同步化后的细胞,检测到细胞呈现出G2/M期阻断、产生多倍体进而凋亡的一系列表型,这与以往报道过的Auora激酶抑制剂的作用表型相同；通过western blotting, immunofluorescence的方法检测到S2作用下内源Aurora B(Thr232)及Histone H3(Ser10)的磷酸化水平大幅下降；利用RNAi的方法检测到化合物对于内源Aurora B激酶活性消减后的细胞的生长抑制能力减弱。通过以上方法初步探明了化合物通过抑制内源Aurora B激酶活性从而抑制肿瘤细胞增殖的机制。通过western blotting的方法我们检测到化合物可以抑制VEGF/VEGFR-2激活的ERK1/2磷酸化水平。利用免疫组化的方法检测了化合物对A375裸鼠移植瘤组织中血管生成的抑制作用。以上结果表明,化合物具有同时抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤血管生成的双重作用。2006年,多靶点药物索拉非尼(Sorafenib)的上市,标志着多靶点靶向性治疗时代的开始。而靶点明确的药物之间联合用药的也是多靶点治疗的策略之一。据报道靶向性抑制Aurora B活性的小分子化合物AZD1152与长春新碱、柔红霉素等具有联用协同作用。因此,我们进一步对化合物S2与其它临床抗肿瘤药物的联合应用能力进行了研究。首先建立了联合用药在细胞水平上的筛选模型,检测了化合物与十五种抗肿瘤药物在九种肝癌细胞株中的联用能力,并选择联合能力好的Rapamycin做进一步研究。在细胞水平上,化合物与Rapamycin联用可以抑制多种肝癌细胞株的生长。流式细胞术检测发现,化合物与Rapamycin联用可以引起Sub-G1细胞比例增长。通过western blotting检测到化合物与Rapamycin联用可以抑制Histone H3(Ser10)的磷酸化水平,初步探明了化合物与Rapamycin联用的机制。在动物水平上,使用了人类QGY裸鼠移植瘤模型检测了化合物与Rapamycin的联用能力,与Sorafenib+Rapamycin阳性对照组相比,化合物与Rapamycin表现出与之相当的联用效果以及较低的毒性。我们还初步检测到化合物与Sunitinib联用可以抑制包括肝癌、宫颈癌、结肠癌等多种肿瘤细胞系的生长,利用流式细胞仪发现化合物与Sunitinib联用可以引起细胞凋亡。此联合应用在体内的效果及其机制正在进一步研究中。此外,我们还对筛选到的阳性化合物S7及S39做了进一步药效药理的研究。使用基于Kinase-Glo发光激酶检测法的Aurora B高通量筛选模型检测了阳性化合物对体外Aurora B激酶活性的抑制能力,发现阳性化合物的抑制能力与VX680相当。利用分子对接的方法模拟了阳性化合物与Aurora B的结合作用。进一步验证了化合物在细胞水平上对肿瘤细胞系的生长抑制的IC50值,两个化合物分别对不同组织来源的细胞系包括肝癌、黑色毒瘤、结肠癌、宫颈癌等显示出不同程度的生长抑制；通过对多种细胞株的时间梯度和药物浓度梯度生长曲线进行检测,测定出化合物对细胞生长抑制的的时间曲线；通过克隆形成率实验证明化合物处理的肿瘤细胞单克隆的形成能力大大下降；通过RNAi的方法发现化合物对内源性Aurora B消减后细胞生长的抑制作用下降。利用流式细胞仪检测到化合物处理的细胞出现显著的G2/M期阻断和细胞凋亡。通过western blotting, immunofluorescence的方法检测到化合物处理的细胞内源Aurora B(Thr232)及Histone H3(Ser10)的磷酸化水平大幅下降。通过以上方法验证化合物对内源性Aurora B活性的抑制,初步探明了化合物抑制肿瘤细胞增殖的机制。为验证化合物在体内对肿瘤生长的抑制作用,我们建立并使用了SMMC7721裸鼠移植瘤模型。化合物S39显示了显著的抑瘤效果及较低的毒性。另外,我们也使用细胞水平上联合用药的筛选模型,初步检测了S7、S39与临床上常用的抗肿瘤药物的联用能力,联合应用的生理现象及机制尚需进一步研究。靶向性治疗已经成为当今肿瘤治疗的重要方向。近年来,针对Aurora B的小分子激酶抑制剂药物也得到了科研界和医药产业界的重视,出现了ZM447439,Hesperadin, AZD1152, VX680等多个已进入临床实验阶段的小分子抑制剂。我们对以Aurora B为靶点的小分子抑制剂的先导化合物进行药效药理学研究,希望能够为研发出具有我国自主知识产权的小分子靶向性新药贡献一点力量。