在人体中,最大的器官是皮肤,它保护我们的机体免受外界的伤害,通过排出汗液带走多余的热量,同时皮肤还能够使我们感知冷暖并抵抗外界的压力。每年因烧伤死亡的人数不在少数。在我国,每年约有上千万人遭受不同程度的烧伤,其中有约5%左右的病人需要进行住院治疗。目前的临床治疗手段对于大面积深度烧伤病人的救治有较高的成活率。但是,烧伤病人治疗后的创面处由于形成瘢痕通常会丧失正常皮肤的许多功能,而疤痕组织由于不含有汗腺,导致汗液无法正常排出体外,丧失部分皮肤的散热功能,对病人的生活质量造成了严重的影响。汗腺的发生是一个非常复杂的过程,由于汗腺细胞是终末分化的体细胞,很难在体外进行大规模的培养。对于大面积深度烧伤病人,无法从病人身上取得自体汗腺细胞,而治疗过程中病人对汗腺细胞的需求量较大,这些问题导致汗腺再生的研究和功能性皮肤重建在临床上的应用发展缓慢。鉴此,如何使汗腺再生,构建功能性皮肤,从而提高大面积深度烧伤病人的生活质量,使目前临床烧伤救治面临的新挑战,其中汗腺再生的研究已经成为重要的课题之一。近年来,随着干细胞研究的深入,在皮肤损伤修复中干细胞发挥了一定的作用,也包括了汗腺的重建,其中骨髓间充质细胞(BMSCs)被用在重度烧伤救治中。虽然研究者对干细胞分化为汗腺细胞的研究取得了一部分进展,但是汗腺分化发育的具体机制还不够明确。因此,从干细胞分化到汗腺细胞的过程中寻找汗腺分化发育的机制,为汗腺的重建研究提供基础,具有重要的临床意义。皮肤组织工程中功能性汗腺的重建工作是当今医学研究的热点和难点问题,汗腺细胞体外培养增殖传代难的问题使得汗腺的重建缺乏种子细胞,干细胞汗腺细胞分化的研究取得了一定的进展,但是在培养体系和分化机制上还存在分歧。鉴此,本课题建立了人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞。同时,本课题证明了分化后的汗腺样细胞与人羊水干细胞相似,具有低免疫原性,为体外功能性汗腺重建提供了种子细胞,具有研究的创新性及重要的临床意义。同时在分化过程中,确定了有关键作用的分子,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供了理论基础,使汗腺的功能性重建成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的生活质量。第一部分人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞及其生物学特性的鉴定目的:建立人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,并建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞,为汗腺的功能性重建提供足够量的种子细胞。方法:(1)人羊水干细胞体外培养鉴定:将收集的羊水样本离心获得细胞,贴壁培养,用胰酶消化细胞,使用磁珠细胞分选法(MACS)对羊水细胞进行免疫磁珠分离,从中分离提取出CD117表达阳性的AFS细胞培养。用流式细胞仪技术测定AFS表面特异性抗原的表达。(2)汗腺细胞的分离培养鉴定:将婴幼儿多指样本去除皮下脂肪,放入含有双抗的PBS中浸泡,随后用PBS漂洗,用眼科剪将皮肤剪成小于1cm×1cm的组织小块,经DispaseⅡ酶4℃消化18小时,用镊子分离表皮和真皮。将去除表皮的真皮组织进一步用胶原酶Ⅳ在培养箱中消化1小时,待汗腺组织游离出,在倒置显微镜下挑取完整的汗腺组织(包括导管和腺体)用胰岛素针拉出盘旋在腺体中的部分导管,并切断导管和腺体的连接处,舍去导管和腺体的中间连接部分,将机械分离的腺体部分用汗腺培养基培养。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;PCR分析汗腺细胞基因表达;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。(3)人AFS细胞向汗腺样细胞分化:收集汗腺腺体细胞条件培养基(CM),使用汗腺腺体分化培养基(汗腺培养基:条件培养基CM=1:1,额外添加50ng/ml的人表皮生长因子)对人AFS进行诱导分化,每天更换培养基。对分化后的汗腺样细胞进行RT-PCR,免疫荧光染色,流式细胞仪和透射电镜的检测。结果:(1)人AFS表达胚胎干细胞标记,部分表达间充质干细胞标记,不表达造血干细胞标记,其分化潜能介于ESCs和成体干细胞之间。(2)光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;体外培养的人汗腺细胞呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;免疫荧光染色结果显示,体外培养的人汗腺细胞表达角蛋白K14、K8、K18,以及汗腺特异性指标CEA。(3)利用汗腺腺体分化培养基(SGDM)成功将人AFS诱导分化为汗腺样细胞,细胞的形态从原来的间充质细胞样转变为上皮细胞样;RT-PCR结果表明汗腺发育相关基因EDA和EDAR在分化第14天有显著的升高,随后在分化28天时下降到正常汗腺细胞水平,汗腺分泌部分相关基因K8和CEA的表达有显著的升高,在28天分化后接近正常汗腺细胞的水平;免疫荧光染色结果表明分化后的汗腺样细胞表达EDA,EDAR,CEA,和K8,与正常人汗腺细胞类似;流式细胞仪技术检测人AFS分化为汗腺样细胞的效率大约为30%;透射电镜结果发现分化后的汗腺样细胞的细胞膜上存在有微绒毛这种汗腺细胞特殊的细胞结构。结论:本研究对人羊水干细胞体外分离,培养和鉴定进行了较全面的分析,并对人汗腺细胞的分离、纯化和传代进行了一系列分析,基本完成了对汗腺细胞的鉴定,这些为进一步研究人汗腺细胞提供了理论依据。在获得了良好的起始细胞和目的细胞的基础上,我们设计了一种全新的诱导分化培养基SGDM,能够诱导人AFS成功分化为汗腺样细胞,得到的汗腺样细胞经过检测与正常人汗腺细胞相类似,这为其他类型的干细胞分化得到汗腺样细胞奠定了基础,同时也为汗腺分化发育的研究提供了一条新的途径。第二部分人羊水干细胞源汗腺样细胞生物学功能的鉴定目的:建立SGDM介导的人AFS分化为汗腺样细胞的方法,并对其生物学特性进行鉴定,同时在分化的过程中,寻找汗腺分化的相关分子。方法:去除未分化的人AFS,将分化后的汗腺样细胞加入体外三位培养胶中,培养21天,取出进行切片,观察胶中的结构;取汗腺样细胞,更换培养基为添加CaCl2的汗腺细胞培养基,使用Fluo 3/AM进行染色,添加不同浓度的乙酰胆碱在共聚焦显微镜下观察Flou 3的荧光信号强度,并且使用流式细胞仪的方法检测荧光强度;将汗腺样细胞和人羊水干细胞与活化的T淋巴细胞共培养,观察在T细胞增殖方面的潜在影响;通过设计几种不同的分化培养基,分析CM中存在的未知因子(UFCM)和额外添加的EGF在SGDM中的作用。结果:(1)免疫组织化学的结果显示,分化后的汗腺样细胞能够在胶中形成类似于正常人汗腺结构的汗腺样结构,并且在胶中形成汗腺样结构的数量大约在24个。免疫荧光染色结果表明,结构中的汗腺样细胞表达汗腺分泌部分的指标EDA,EDAR,CEA,K8,K18,EMA,CD133和Na-K ATPase;(2)通过荧光强度的反映,乙酰胆碱提高了细胞中游离的Ca2+浓度,结果表明分化后的汗腺样细胞具有部分汗腺的功能性;(3)与活化的T细胞共培养,结果表明汗腺样细胞与人羊水干细胞相类似,具有低免疫原性;(4)几种不同分化培养基分化后细胞RT-PCR结果表明UFCM在SGDM中具有重要的作用,而EGF则可以提高SGDM的分化效率,进一步检测发现Shh可能包含在CM中并在汗腺样结构形成的过程中起重要作用。结论:在由汗腺腺体诱导分化培养基SGDM介导的人AFS分化为汗腺样细胞的过程中,鉴定得到的汗腺样细胞的功能型,包括分泌汗液的潜能,体外三维培养形成汗腺样结构的能力,抑制T细胞活化的能力,并在分化过程中寻找到存在于CM中与汗腺样结构形成相关的分子——Shh。这为干细胞分化为汗腺细胞的研究提供了一种新的方法,同时为汗腺分化发育的研究奠定了基础,使汗腺的功能型重建成为可能。