论文部分内容阅读
目的 研究锰处理对原代培养大鼠丘脑星形胶质细胞损伤及谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酰胺酶(GS)活力的影响及对氨基水杨酸钠(PAS-Na)的防护作用。方法 (1)原代培养的丘脑星形胶质细胞经过纯化和鉴定后,①锰毒性试验,分别经0、125、250、500、1000μmol/L MnCl2单独作用6h、12h、24h和48h。② PAS-一a无毒性筛选试验,单独给予0、50、150、450和1350 μmol/L PAS-Na单独作用6h、12h、24h和48h,AS-Na干预剂量筛选实验,丘脑星形胶质细胞被随机分为正常对照组(对照组)、500Mn、500Mn+50 PAS-Na、500Mn+150PAS-Na、500Mn+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干预组。对照组星形胶质细胞用普通培养液培养48h；染锰组、500Mn+50PAS-Na、 500Mn+150PAS-Na、500Mn+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干预组星形胶质细胞暴露于MnCl2500μmol/L培养液培养48h。随后,吸出旧培养液,500 Mn+50PAS-Na、500Mn+150PAS-Na、500Mn+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干预组分别用含PAS-Na 50、150、450、1350μol/L的培养液培养6h、12h、24h和48h。用CCK8法和LDH测定试剂盒测定细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。选择合适的Mn处理及PAS-Na干预剂量和时间。(2)用高效液相色谱(HPLC)和GS试剂盒测定原代培养的星形胶质细胞Glu、Gln、Gly、GABA和GS的活性。原代培养的丘脑星型胶质细胞被随机分为对照组、500Mn组、50PAS对照组、150PAS对照组、450PAS对照组、500Mn+50PAS组、500Mn+150PAS组、500Mn+450PAS组。对照组、50PAS对照组、150PAS对照组、450PAS对照组细胞给予普通培养液培养48小时；500Mn组、500Mn+50PAS组、500Mn+150PAS组、500Mn+450PAS组细胞暴露于MnCl2500μmol/L培养液培养48小时。吸出旧培养液后。50PAS对照组、150PAS对照组、450PAS对照组、500Mn+50PAS组、500Mn+150PAS组、500Mn+450PAS组分别给予含PAS-Na 50、150和450μmol/L的培养液培养24小时。其余各组用普通培养液培养24小时。结果 (1)细胞存活率检测结果显示：①锰毒性试验中,与对照组比较,除了125μmol/L MnCl2处理6h组,其他组丘脑星形胶质细胞存活率下降,有一定的时间和剂量反应趋势(P<0.05)；②在PAS-Na无毒浓度筛选实验中,与对照组比较,1350μmol/L PAS-Na处理48h组丘脑星形胶质细胞存活率降低(P<0.05)；其他各剂量处理组在不同时间的细胞存活率无明显变化(P>0.05)。③ PAS-Na干预剂量筛选实验中,与对照组比较,500μmol/L MnCl2组星形胶质细胞存活率降低(P<0.05);50、150、450 μmol/L PAS-Na干预24h和48h后,星形胶质细胞存活率均显著升高(P<0.05),但无时间效应关系。(2)细胞LDH漏出率结果显示：①锰毒性试验中,与对照组比较,250、500和1000μmol/L MnCl224h处理组和125～1000μmol/L MnCl248h处理组星形胶质细胞LDH漏出率升高,具有一定的时间/剂量反应关系(P<0.05)；②在PAS-Na无毒浓度筛选实验中,PAS-Na单独作用于星形胶质细胞48小时后,1350μmol/L组星形胶质细胞LDH漏出率升高(P<0.05)；其他各剂量处理组在不同时间的细胞LDH漏出率无明显改变(P>0.05)。③PAS-Na干预剂量筛选实验中,与对照组比较,500 μmol/L MnCl2组LDH漏出率明显升高(P<0.05);150、450、1350μmol/L PAS-Na干预24h和50、150、450、1350μmol/L PAS-Na干预48小时使细胞LDH漏出率降低(P<0.05)；与对照组比较,50、150、450、1350μmol/L PAS-Na对照组(24和48小时)细胞LDH漏出率未见明显变化。故在后续实验中,我们选择500μmol/L MnCl2和48h作为锰处理的剂量和时间。同时,我们选择50、150、450μmol/L PAS-Na干预24h,作为干预剂量和时间。(3) HPLC和GS试剂盒结果显示：与对照组比较,染锰(500μmol/L) 48小时组丘脑星形胶质细胞内Gln和GABA含量降低,GS活性降低,Glu和Gly含量升高(P<0.05)；500Mn组丘脑星形胶质细胞外液Glu和Gly含量比对照组高,Gln含量比对照组高(P<0.05),而GABA含量没有显著变化(P>0.05)；与500Mn组比较,500Mn+450PAS组细胞内和500Mn+150PAS、 500Mn+450PAS细胞外Glu含量降低,500Mn+450PAS组细胞内和500Mn+50PAS、500Mn+150PAS、500Mn+450PAS组细胞外Gln含量升高,500Mn+150PAS、500Mn+450 PAS组细胞内Gly降低,500Mn+150PAS、 500Mn+450 PAS组细胞内GABA含量升高(P<0.05)。500Mn组GS活性比对照组低；与500Mn组比较,500Mn+450 PAS组GS活性升高。结论体外实验中,锰处理会对原代培养的大鼠丘脑星形胶质细胞造成损伤,导致Glu、Gln、Gly、GABA及GS活性异常改变。PAS-Na对锰导致丘脑星形胶质细胞毒性、Glu、Gln、Gly、GABA含量及GS活性改变具有干预作用。