植物激素脱落酸（abscisic acid,ABA）可以调节植物抗逆（包括干旱、冷害、盐害等）的多种生理反应和分子生物学效应。一氧化氮（nitric oxide,NO）是一种多功能生物活性分子,作为信号参与基因活化、蛋白质表达和酶活性的调节使植物对逆境胁迫做出应答。最近的研究表明ABA和水分胁迫都可以引起NO和过氧化氢（hydrogenperoxide,H₂O₂）的产生,以及细胞质Ca²⁺([Ca²⁺]i)和钙调素（calmodulin,CaM）增加,诱导抗氧化基因的表达,提高植物抗氧化防护能力。NO在ABA诱导的抗氧化防护中起重要作用。然而,有关NO作为信号分子介导ABA诱导的抗氧化防护信号转导机制仍有待阐明。本研究以玉米叶片为材料,研究了在ABA和水分胁迫诱导的抗氧化防护中NO的作用以及H₂O₂,Ca²⁺/CaM与NO之间的关系。主要的研究结果如下:用NO特异的荧光染料4’5’—二氨基荧光素二乙酸酯（4,5-diaminofluoresceindiacetate,DAF-2DA）对小块叶片进行染色,并用激光共聚焦显微镜（confocal laserscanning microscopy,CLSM）观察荧光变化。10 mM CaCl₂处理迅速诱导NO产生和NOS活性增加。CaCl₂处理1h时NO达到最大值并一直持续到2h,2h后开始减弱。在CaCl₂处理1h时,细胞溶质和微粒体部分一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS）活性达到最大值,分别比对照增加了92.7%和148%。NO清除剂c-PTIO（2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）,NOS抑制剂_L-NAME（N^G-nitro-_L-Arg methylester）、PBITU（S,S’-1,3-phenylene-bis（1,2-ethanediyl）-bis-isothiourea）和CaM拮抗剂预处理都抑制了CaCl₂诱导的NO产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性增加。另一方面,Ca²⁺抑制剂和CaM拮抗剂预处理几乎完全抑制了ABA和H₂O₂诱导的NO产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性的增加,表明玉米叶片中ABA和H₂O₂是通过Ca²⁺-CaM依赖型的NOS途径诱导NO产生的。研究还发现外源NO处理显著提高了玉米叶片叶肉细胞[Ca²⁺]_i、玉米叶片CaM1基因表达和CaM含量。NO清除剂c-PTIO和NOS抑制剂_L-NAME预处理部分抑制了ABA处理后期[Ca²⁺]_i和CaM含量的提高,表明NO参与ABA诱导的Ca²⁺/CaM水平增加。此外,Ca²⁺鳌合剂、Ca²⁺通道阻塞剂和CaM拮抗剂预处理还显著抑制了NO诱导的抗氧化防护基因SOD4、cAPX、GRl表达和叶绿体及细胞溶质抗氧化酶SOD、APX、GR活性的增加,说明玉米叶片中NO诱导的Ca²⁺/CaM增加参与了NO诱导的亚细胞抗氧化防护系统。这些结果暗示了Ca²⁺/CaM作为NO的上游和下游信号分子参与ABA和H₂O₂诱导玉米叶片抗氧化防护。水分胁迫处理能够诱导玉米叶片叶肉细胞NO的产生。水分胁迫处理1h时NO开始产生,一直持续到4h达到最大,4h后减弱。水分胁迫诱导了NOS活性增加,水分胁迫处理4h时细胞溶质部分NOS活性是对照的4.3倍,微粒体部分的NOS活性是对照的7.2倍。这些结果表明微粒体部分NOS活性比细胞溶质部分高且更容易受到水分胁迫的影响。NOS抑制剂_L-NAME和PBITU预处理显著抑制了水分胁迫诱导的细胞溶质和微粒体部分NOS活性的增加,而NO清除剂c-PTIO和硝酸还原酶_{nitrate reductase,NR}抑制剂KCN、NaN₃抑制了水分胁迫诱导的NO产生,但并不影响NOS活性。结果表明NOS是水分胁迫诱导NO产生的主要来源,NR也部分参与了水分胁迫诱导的玉米叶片NO的产生。分别用DAB（3,3-diaminobenzidine）染色的组织化学、分光光度计法和CeCl₃染色的细胞化学方法检测了NO对水分胁迫诱导的H₂O₂累积的影响。结果显示SNP提高了水分胁迫诱导的叶绿体和细胞溶质谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX）的活性,减少了水分胁迫诱导的H₂O₂的积累,而[Fe（Ⅲ）CN]在一定程度上降低了亚细胞抗氧化防护酶的活性,不影响H₂O₂的积累。施用NO清除剂、NOS抑制剂和NR抑制剂的研究结果表明NO参与外源H₂O₂和水分胁迫诱导的SOD4、cAPX、GRl的表达和叶绿体及细胞溶质抗氧化防护酶SOD、APX、GR活性的提高。这些结果表明NO能够清除水分胁迫诱导产生的H₂O₂至少部分归因于NO诱导的不同亚细胞分隔抗氧化防护的协同作用。对水分胁迫下ABA积累、Ca²⁺/CAM增加和NO产生之间的关系的研究结果显示,水分胁迫积累的内源ABA是水分胁迫诱导NO产生和激活NOS活性的关键诱导因子;NO参与了水分胁迫诱导的ABA积累、[Ca²⁺]_i提高、CaM1基因表达和CaM含量的增加。另一方面,Ca²⁺抑制剂和CaM拮抗剂预处理几乎完全抑制了水分胁迫诱导的NO的产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性的增加,表明Ca²⁺/CaM介导了水分胁迫诱导的玉米叶片NO的产生。此外,研究还发现水分胁迫诱导叶绿体和线粒体NO产生,Ca²⁺鳌合剂和CaM拮抗剂预处理只抑制了水分胁迫诱导的线粒体NO产生而对叶绿体NO的产生没有影响,表明在玉米叶片叶绿体和线粒体中合成NO的NOS种类可能有所不同。上述研究表明,ABA和水分胁迫诱导的[Ca²⁺]_i和CaM含量的增加激活了NOS活性合成NO,NO又反过来影响Ca²⁺/CaM水平,进而提高不同亚细胞分隔抗氧化酶活性及相关基因的表达。NO和Ca²⁺/CaM之间的交叉谈话在外源ABA或水分胁迫积累的ABA信号转导过程中起重要作用。