冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，其感染宿主范围十分广泛，包括鸟类、人以及其他哺乳动物。根据国际病毒分类委员会第九次报告，冠状病毒可分为α、β、γ、δ4个属。在冠状病毒编码的蛋白中，除了传统的结构蛋白和非结构蛋白，还存在数量不等、零散分布在结构蛋白之间或内部的辅助蛋白(accessory protein)。这些辅助蛋白具有种属特异性，与其他已知蛋白没有同源性或者同源性非常低。根据目前关于SARS-CoV等冠状病毒辅助蛋白的研究结果，证实冠状病毒辅助蛋白是病毒复制非必需的，但参与了免疫调控，并且与病毒的毒力相关。　　2014年美国首次报道猪场爆发猪δ冠状病毒(PDCoV)，引起新生仔猪的腹泻、呕吐、死亡。随后，多个国家报道了该病的发生与流行，引起养猪业的高度关注。根据基因组序列预测PDCoV可编码两个辅助蛋白NS6和NS7，但没有得到实验验证，其功能也有待分析。另外，除了NS6和NS7外，PDCoV是否还编码其它的辅助蛋白也不清楚。因此，本研究以PDCoV CHN-HN-2014毒株为代表，对其假定编码的辅助蛋白进行鉴定，同时探究它们与宿主天然免疫反应之间的关系。具体研究内容如下:　　1.PDCoV辅助蛋白NS6的鉴定　　参照PDCoV CHN-HN-2014全基因组序列，设计两条特异性引物(Leader-F，NS6r)，分别位于基因组5端前导序列以及NS6基因3末端。提取病毒感染的细胞总RNA，进行RT-PCR和测序分析，结果显示NS6是一个独立的亚基因组(subgenomic RNA，sgmRNA)，采用了非经典的调控序列(transcription regulating sequences，TRS)，且位于预测的TRS上游。随后，通过单克隆抗体的制备成功获得两株稳定分泌NS6特异性抗体的杂交瘤细胞。间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析表明:两株单抗（2G3和4B9）可特异性识别过表达的NS6蛋白或PDCoV感染的LLC-PK1细胞，证实NS6蛋白在病毒感染早期表达，而且定位于细胞质中。进一步分析发现，NS6蛋白主要定位于内质网和内质网高尔基体室，部分定位于高尔基体。这些结果首次证实了NS6蛋白在PDCoV感染细胞中的表达，而且NS6是一个独立的亚基因组，采用了非经典的TRS(ACACCT)。　　2.PDCoV辅助蛋白NS7的鉴定及NS7a的发现　　根据预测的PDCoV NS7的序列，设计引物将预测的NS7基因克隆至pGEX-KG原核表达载体中，获得重组质粒pGEX-KG-NS7。随后，经IPTG诱导表达获得GST-NS7融合蛋白，进一步通过单克隆抗体制备成功获得4株稳定分泌NS7蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞。IFA证实4株单克隆抗体都能特异性识别PDCoV感染的或过表达NS7的LLC-PK1细胞。Western blot分析发现，4株单克隆抗体与PDCoV感染的细胞反应时，除了能检测到NS7蛋白条带外，还出现了一条大小约12kDa的特异性蛋白条带。但是，这个小蛋白条带在过表达NS7的细胞中并没有出现。随后，通过分析PDCoV感染细胞后病毒的亚基因组RNA，发现存在一条采用非经典TRS的新的亚基因组RNA，其ORF的3末端与NS73末端完全相同，可编码大小为100个氨基酸的多肽，说明可能存在一个新的辅助蛋白，将其命名为NS7a。进一步研究发现，过表达的NS7a蛋白能被4株针对NS7的单克隆抗体特异性识别，并且与病毒感染条件下检测到的较小的蛋白大小一致。这些结果表明PDCoV确实编码了一个新的辅助蛋白NS7a，是一个独立的亚基因组，而且采用了非经典的TRS(ACCCCA)。　　3.PDCoV辅助蛋白NS6拮抗IFN-β产生的机制　　先前的研究已经证实PDCoV编码了3个辅助蛋白(NS6、NS7、NS7a)，但是这些辅助蛋白是否也具有免疫调节功能尚不清楚。因此，我们以NS6为代表对PDCoV辅助蛋白调控天然免疫的特性进行了进一步研究。将NS6克隆至pCAGGS-HA载体中获得真核表达质粒pCAGGS-HA-NS6，转染细胞进行超表达，发现NS6蛋白能显著抑制仙台病毒(Sendai virus，SeV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β蛋白表达，而且抑制SeV诱导的关键转录因子IRF3和NF-κB的磷酸化以及入核，表明NS6蛋白能够拮抗IFN-β产生。但令人惊奇的是，NS6蛋白对RLRs(RIG-I-like receptors)信号通路关键分子(RIG-I/RIG-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3)介导的IFN-β启动子活性并没有抑制作用，提示NS6蛋白可能靶向RIG-I/MDA5或其上游。同时，通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和IFA分析发现，NS6与RIG-I/MDA5存在相互作用，而且这种相互作用并不依赖于RNA;进一步分析表明，NS6蛋白与RIG-I的CTD区域以及MDA5的Hel和CTD区域发生相互作用，RNA pull-down分析证实NS6不是一个RNA结合蛋白。随后的Co-IP竞争性试验结果也证实NS6蛋白能显著减弱RIG-I/MDA5与dsRNA的结合。上述结果表明NS6采用了一种新的免疫抑制策略，抑制RLRs介导的IFN-β产生。