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植物真菌病害严重威胁着我国农作物的产量和质量,生产上急需有效的控制手段。目前真菌病害的防治主要以传统的抗病育种和化学防治为主,但抗病育种周期长,选育新品种较为困难,化学农药的大量使用亦造成环境污染同时产生安全隐患。当前是倡导环境友好型和发展可持续农业的社会,植物真菌病的防治是一个亟待解决的难题。现代转基因技术恰是解决这些问题的最优选择。该技术将外源抗性基因转入到植物中,从而有效的提高植物对真菌病的抵御能力。抗性基因可以是从异源物种中获得,这个是通过传统育种无法完成的。本文所涉及到的β-1,6-glucanase-GluM蛋白是从实验室保存的粘细菌Corallococcus sp.EGB中分离纯化得到的一种新型广谱抗真菌蛋白,可以特异性地水解β-1,6-糖苷键键合的葡聚糖。β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁的关键组分,起着将β-1,3-葡聚糖纤维交联成束及将细胞壁蛋白连接到β-1,3-葡聚糖上的功能,其水解将导致整个细胞结构的破坏,达到杀死病原真菌的作用。GluM独特而专一的作用方式使得该蛋白在植物病害防治方面具有重要的应用价值。本文首先选用模式植物拟南芥对gluM基因的抗真菌活性进行验证。将目的基因与拟南芥植物表达载体pSuper-1300+连接,构建拟南芥重组载体pSuper-1300-gluM,用农杆菌GV3101介导法将目的基因转化到拟南芥Col-0中。通过潮霉素抗性筛选和提取总DNA进行PCR验证,获得50株T0代阳性植株,选择部分株系种子进行筛选,最后获得8株纯合体。选取6株纯合体进行灰霉抗性实验,最后选取效果最好的植株进行进一步抗性验证。灰霉抗性实验结果表明,在灰霉侵染5d后发现WT和含有载体pSuper-1300+的纯质粒转基因植株(V)的叶片出现大面积的水渍斑、黄化,而gluM转基因植株发病的病斑分散并且较小,对发病指数进行统计,转基因植株的发病指数为20.32,明显低于WT(44.85)和V(45.93),分别提取灰霉侵染0h,2d,3d的WT、V和转基因植株的总RNA,用gluM基因引物做RT-PCR检测,结果显示,gluM基因植株扩出相应的目的条带,WT和V都没有条带扩出。表明gluM基因在植株体内获得转录,灰霉BCACTIN基因的RT-PCR检测可知,转基因体内的灰霉表达量更少。通过对侵染5d的叶片进行台盼兰染色发现相比于WT和V,转基因植株叶片的死细胞染色斑分布零散,稀少。测定侵染6d后的叶绿素含量表示,转基因植林的叶绿素含量残余更多,分别比WT、V高22.06%,22.52%。这些结果初步证明:gluM基因在拟南芥中可以正常表达,该基因的转入可以提高拟南芥对灰霉的抗病能力。为了验证gluM基因在转基因作物育种中的潜在应用价值,构建gluM基因转水稻进行真菌抗性研究。将改造好的目的基因与水稻表达载体pCAMBIA1300s连接,构建水稻重组载体 pCAMBIA1300s-△26-gluM、pCAMBIA-1300s-ER-gluM。用农杆菌EHA105介导法将重组载体导入水稻粳稻品种日本晴(Nipponbare)中,经提取总DNA进行PCR验证后获得T0代pCAMBIA1300s-ER-glwM阳性克隆7株,pCAMBIA1300S阳性植株10株;pCAMBIA1300s-△26-gluM阳性克隆仍未收到种子。生长3周的T0代水稻苗进行叶片孢子点染实验,选取稻瘟菌株P131,用浓度为1 ×105 spores/mL孢子液点在水稻叶片上均匀分布的3个位置进行侵染。培养7 d后观察发现,WT、V出现典型的病斑,转基因水稻的叶片没有出现。生长2周的T1代水稻苗进行叶鞘侵染实验,培养1-2d后观察稻瘟病菌在叶鞘细胞中的生长情况,WT的侵入率为70%,V的侵入率为43%,转基因ER-gluM植株的侵入率为0。由此可见,与WT和V植株相比,T1代的gluM转基因水稻对稻瘟菌株P131相具有更高的抗性。根据以上实验结果可以初步说明:gluM基因的转入可以有效的增加水稻对稻瘟病菌的抗性。本文通过对β-1,6-glucanase编码基因gluM的转基因植物抗性水平进行验证,发现该基因的转入可以有效提高植株的抗病能力,说明gluM基因在植物病害的生物防治领域具有重要的潜在应用价值。