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一、研究背景和目的腺病毒（Adenoviruses,AdVs）是一种双链DNA病毒,无包膜,分子结构由两部分组成:一部分是由蛋白质组成的外部衣壳,另一部分是包裹在衣壳中的线性双链DNA遗传物质,基因组长度约为25-45kb。人腺病毒（Human adnoviruses,HAdVs）属于腺病毒科中的哺乳动物腺病毒属,可分为7个种（A、B、C、D、E、F和G）,目前已发现90种基因型,腺病毒在免疫力低下的婴幼儿、儿童、老年人,接受器官或干细胞移植的免疫力抑制患者及军队中的新兵三类人群中易感,腺病毒感染可引起呼吸道、胃肠道、泌尿道、眼部疾病。腺病毒载体因其众多优点已成为当今最热门的用于构建重组病毒载体之一,近年来,新的重组腺病毒载体在许多领域得到了应用,它们在基础和临床研究方面取得了很大进展,成为最有前途的病毒载体之一。然而,目前腺病毒载体的研究缺乏合适的动物模型是亟待解决的问题之一。在本研究中,我们构建了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的复制型人5型重组腺病毒rAd5E1,该复制型重组腺病毒后期可用于动物模型的研究。二、研究方法1.构建插入目的基因E1的穿梭质粒psAd5E1用A549细胞培养野生型HAdV-5,从培养的病毒液中提取总DNA,从穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1的多克隆位点挑选两个合适的限制性酶酶切位点NotI、XhoI,利用PCR扩增出带上酶切位点的目的基因E1,利用酶切连接的方式使穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1与基因E1连接得到新的穿梭质粒psAd5E1。2.构建重组腺病毒质粒prAd5E1将用PmeI酶线性化的穿梭质粒psAd5E1与骨架质粒pAdEasy-1共同转化至大肠杆菌BJ5183内,利用细菌内同源重组酶重组得到重组腺病毒质粒prAd5E1。3.包装重组腺病毒rAd5E1将重组腺病毒质粒prAd5E1用PacI酶线性化后转染到AD293细胞包装出重组腺病毒rAd5E1。4.验证重组腺病毒rAd5E1的复制性将重组腺病毒rAd5E1感染A549细胞,并在A549细胞连续传代至第三代。4.RT-PCR、Western Blot检测重组腺病毒rAd5E1目的基因E1的表达将第二代重组腺病毒rAd5E1感染A549细胞,收集培养物提取RNA,RNA逆转录为cDNA后,分别PCR扩增目的基因E1的三个基因E1A、E1B19K、E1B55K,产物电泳观察目标条带。以空白A549细胞为阴性对照,第二代重组腺病毒rAd5E1为实验组样本,野生型人5型腺病毒为阳性对照,鼠抗HAdV-5 E1A蛋白单克隆抗体为一抗、goat anti-mouse IgG（H+L）-HRP conjugate 抗体为二抗进行 Western Blot 实验,显影后观察目标条带。6.测定重组腺病毒rAd5E1的复制动力学以荧光形成单位（Fluorescence Forming Unit,FFU）分别测定重组腺病毒rAd5E1、野生型HAdV-5的滴度,以相同感染复数（MOI）的两种病毒感染A549细胞,分别于12、24、36、48、60、72、84小时收获,利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR System,QPCR）、半数组织培养感染剂量（50%tissue culture infective dose,TCID50）测定病毒的复制动力学,将所得数值绘制两种病毒的生长曲线。三、结果1.克隆穿梭质粒psAd5E1的构建经克隆穿梭质粒的目的基因E1 PCR、克隆穿梭质粒用NotI、XhoI双酶切释放目的基因E1、克隆穿梭质粒的大小及测序等多种方法鉴定,筛选出正确的克隆穿梭质粒psAd5E1。2.重组腺病毒质粒prAd5E1的构建经重组腺病毒感染性克隆质粒的目的基因E1 PCR、大小、五种限制性酶酶切及测序鉴定,筛选出正确的重组腺病毒质粒prAd5E1。3.重组腺病毒rAd5E1的包装重组腺病毒质粒prAd5E1转染AD293细胞后,于荧光显微镜下观察,细胞荧光数及细胞病变效应（CPE）随着培养时间逐渐增多、明显,重组腺病毒rAd5E1包装成功。4.重组腺病毒rAd5E1复制性验证重组腺病毒rAd5E1在A549细胞中连续传代,每代细胞于荧光显微镜下观察,细胞荧光数及CPE随着培养时间逐渐增多、明显,复制型重组腺病毒rAd5E1构建成功。5.RT-PCR、Western Blot验证重组腺病毒rAd5E1目的基因E1的表达RT-PCR、Western Blot结果均出现了与阳性对照一致的目标条带,重组腺病毒rAd5E1的目的基因E1在A549细胞内正确转录、翻译表达。6.重组腺病毒rAd5E1的复制动力学测定成功测定重组腺病毒rAd5E1、野生型HAdV-5的复制动力学,绘制了病毒的生长曲线,重组病毒DNA复制水平与野生型相似,而感染性病毒的滴度略低于野生型病毒。四、结论1.成功构建了表达GFP蛋白的复制型重组腺病毒prAd5E1载体。2.复制型人5型重组腺病毒rAd5E1可表达绿色荧光蛋白,成功构建了表达GFP蛋白的复制型重组腺病毒prAd5E1载体。3.复制型人5型重组腺病毒rAd5E1可用于后续动物模型的研究。