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卵巢癌发病率排女性生殖系统恶性肿瘤第3位,而死亡率排妇科恶性肿瘤之首。世界范围来看,卵巢癌发病率在发达国家为9.1/10万,而在发展中国家为5.0/10万,2017年,美国女性约有22440人罹患卵巢癌,其中14080人死于卵巢癌。2015年,中国约有52100名女性被确诊为卵巢癌,约22500名女性患者死于卵巢癌。上皮性卵巢癌按病理分型主要有浆液性卵巢癌,粘液性卵巢癌,透明细胞癌和子宫内膜癌四种类型。尽管被称为“无声杀手”,但超过80%的病人仍有症状,并且这些症状与妇女生理状况、胃肠道疾病及泌尿系疾病的症状相似,容易导致误诊。卵巢癌细胞可通过腹膜种植、血液及淋巴进行转移,只有20%的病人能够在卵巢癌局限于卵巢组织内（Ⅰ期）时被发现,90%早期发现患瘤的病人可以得到预后较好的治疗。当疾病波及盆腔器官（Ⅱ期）,腹腔（Ⅲ期）及转移超出腹膜（Ⅳ期）时,卵巢癌的治愈率及预后逐期递减,所以卵巢癌的早期诊疗至关重要。尽管肿瘤标记物CA-125的应用已经提高了卵巢癌的筛查效率,但是其他疾病能累及腹膜及胸膜的疾病也会导致CA-125升高,所以CA-125诊断卵巢癌的的特异度并不高,仍然会导致误诊。所以,临床上亟需发现新型无创、高灵敏度及特异度的肿瘤标记物。尽管70%的术后病人对铂类及紫杉醇类药物敏感,但是在服用一定疗程后会发生耐药,耐药问题促使研究者寻找新的敏感药物对其进行治疗。早在2004年就有多个研究组发现,DOG1在胃肠间质肿瘤中高表达,后来陆续在口腔癌中发现高表达,造成相同基因的不同命名如TMEM16A,TAOS2,ORAOV2。直到在2008年,三个独立的实验室同年发现DOG1基因表达的是一种钙激活氯离子通道蛋白,并重新命名为ANO1（anoctamin 1）。Anoctamin家族包括10名成员,分别为ANO1-10。目前的研究表明,ANO1和ANO2两个成员具有氯离子通道的功能。ANO1具有10跨膜区域的蛋白结构,广泛表达于具有分泌作用的腺体上皮细胞中,包括唾液腺、胰腺等腺体,气道上皮,平滑肌及感觉神经元中。ANO1功能主要是介导跨上皮的例子转运及调节气管液体分泌、胃肠蠕动、外分泌腺分泌、肾脏功能及平滑肌收缩及伤害感知。近几年来的研究表明,ANO1在多种上皮来源的肿瘤如头颈淋巴癌、肺癌、胃癌、胃肠间质瘤、前列腺癌、口腔癌、胰腺导管癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等肿瘤组织中高表达,并促进肿瘤的发生与发展。卵巢癌以上皮细胞来源的肿瘤常见,上皮性卵巢癌占到卵巢癌的90%。既然ANO1高发于上皮起源的肿瘤中,那么在上皮性卵巢癌组织的表达如何呢?ANO1是否也具有或通过什么机制促进上皮性卵巢癌发生与发展的作用?为了回答这些问题,本课题从收集卵巢癌病人的卵巢癌组织标本入手,在发现ANO1蛋白在卵巢癌组织标本有高表达的基础上,采用基因沉默、生物化学、细胞生物学、药理学和整体荷瘤小鼠模型等手段开展了针对ANO1在卵巢癌的发生与发展中作用的确证研究及可能的作用机制。目的:探讨ANO1在人上皮性卵巢癌发生与发展中的作用及可能的作用机制。方法:采用免疫组化方法检测ANO1在人正常卵巢组织,人卵巢良性肿瘤及恶性肿瘤中的表达,评估ANO1表达程度与性别、病理分化程度,病理分期及病理类型等临床参数的相关性。荧光定量PCR（聚合酶联反应）方法检测正常人群及卵巢癌患者的外周血单个核细胞中ANO1 mRNA的扩增水平。Western-blot方法检测ANO1蛋白在卵巢癌细胞中的表达。在来源于浆液性卵巢癌的SKOV3和Caov-3及来源于透明细胞癌组织的ES-2细胞系中检测ANO1的表达情况。通过设计针对ANO1的siRNA干扰序列（ANO1-siRNA1,ANO1-siRNA2）和无干扰作用的混乱序列（Scrambled siRNA）作为对照,应用瞬时转染技术沉默ANO1基因,在细胞水平上研究ANO1对卵巢癌的作用。MTT法检测沉默ANO1对SKOV3细胞活性的作用。EdU法检测沉默ANO1对SKOV3细胞DNA复制的影响。软琼脂平板克隆形成实验检测沉默ANO1对细胞增殖能力的影响。划痕实验评估沉默ANO1对SKOV3细胞迁徙能力的影响。Transwell实验评估沉默ANO1对SKOV3细胞侵袭能力的影响。体内实验评估沉默ANO1对异植瘤生长能力的影响。PDX（Patient-derived xenograft）实验评估沉默ANO1对PDX异植瘤生长的影响。细胞汇合度及Western-blot实验探索沉默ANO1抑制肿瘤生长的作用机制及涉及的细胞信号通路。结果:1.采用免疫组化的方法检测了正常卵巢组织12例,卵巢癌患者74例（粘液性癌40例,浆液性癌18例,子宫内膜样癌12例,透明细胞癌4例）,卵巢良性肿瘤38例。免疫组化结果显示,ANO1在正常卵巢组织中阳性表达有0例,表达率为0%;在卵巢良性肿瘤中阳性表达有7例,表达率为18.4%;在卵巢癌中阳性表达有58例,表达率为78.3%。卡方检验统计表达率之间有统计学意义。在卵巢癌患者组织中,卡方检验分析显示,根据FIGO（International Federation of Gynecology and Obstetrics）病理分期,III/IV晚期患者组高表达ANO1率为72.4%,I/II早期患者组高表达ANO1率为27.6%,两组ANO1的表达有统计意义。高分化、中分化与低分化高表达ANO1率分别为12.6%、60%、57.1%。结果表明越是晚期,分化程度越差,ANO1的表达越高。ANO1的表达程度跟年龄分组及病理类型不相关,而跟病理分期及分化程度相关。2.RT-PCR结果表明ANO1基因在浆液性卵巢癌患者的外周血单个核细胞中扩增水平较高,其相对?-actin的扩增水平平均值为6.8×10-3。而非癌患者组外周血中的ANO1mRNA全部处于较低扩增水平,其扩增水平相对?-actin的平均值为7.8×10-5。两组均值相差近百倍,具有统计学意义。9例在外周血单个核细胞中高扩增ANO1基因的浆液性卵巢癌患者有7例在术后ANO1扩增水平明显下降。表明ANO1的基因扩增与卵巢癌相关。3.Western-blot实验结果显示,ANO1蛋白在来源于浆液性癌的SKOV3及Caov-3细胞系中高表达,而在来源于透明细胞癌的ES-2细胞中低表达。4.选择ANO1表达较高的细胞系SKOV3进行沉默ANO1作用的研究。Western-blot实验结果显示,对照组的ANO1高表达,scrambled siRNA组的ANO1也高表达,表达水平与对照组一致。而ANO1 siRNA1组与ANO1 siRNA2组的ANO1表达明显受到抑制。说明干扰序列能有效的沉默ANO1.5.MTT实验结果显示,相对于Scrambled siRNA组,转染ANO1-siRNA1和ANO1-siRNA2而沉默SKOV3细胞中的ANO1后,SKOV3细胞活力显著降低。并且ANO1-siRNA2的抑制效率更高。6.EdU实验结果显示,ANO1-siRNA2组细胞核中掺入的Edu数量要少于Scrambled siRNA组,表明沉默ANO1表达后,SKOV3细胞的DNA复制过程受到抑制。7.软琼脂克隆形成实验表明,当沉默SKOV3细胞系中ANO1后ANO1-siRNA2组中细胞克隆数明显少于Scrambled siRNA组。表明沉默ANO1后SKOV3细胞的增殖能力及群体依赖生长能力降低。8.划痕实验显示,ANO1-siRNA2组不同时间点的空白面积多于Scrambled siRNA组,划痕闭合明显变慢。表明沉默ANO1后抑制了SKOV3细胞的迁移能力。9.Transwell实验结果显示,ANO1-siRNA2组穿过基质胶到达下室的细胞明显少于Scrambled siRNA组,表明沉默ANO1能抑制SKOV3细胞的侵袭能力。10.体内实验显示,PBS对照组瘤体的平均体积及瘤重为837.5±102.7mm3和1.7±0.17g,ANO1-siRNA2组瘤体的平均体积及瘤重为267.5±46.62mm3和0.63±0.15g,Scrambled siRNA组瘤体的平均体积及体重为860.5±64.3mm3和1.8±0.22g。结果表明,沉默ANO1能明显抑制裸鼠体内SKOV3细胞所致异植瘤的生长。11.Patient-derived Xenugraph（PDX）实验的免疫组化结果显示,在4例来源于浆液性卵巢癌的患者组织中,OVPF160087患者的ANO1高表达（+++）,OVPF004、OVPF031、OVPF027三例患者都是中度表达（++）。随机选取OVPF004构建PDX模型进行体内实验。实验结果表明沉默ANO1能抑制PDX异植瘤的生长。12.机制研究的结果显示,在来源于浆液性癌的SKOV3及Caov-3细胞系中,沉默ANO1基因后会降低ANO1蛋白表达及Akt的磷酸化水平。细胞融合实验显示,采用PI3K信号通路抑制剂LY294002作用于正常表达及沉默ANO1的SKOV3及Caov-3细胞系中,ANO1的促SKOV3及Caov-3细胞生长作用明显受到抑制。结果表明,阻断PI3K-Akt信号通路能阻断ANO1促癌细胞生长作用,ANO1可能通过激活PI3K-Akt信号通路发挥在上皮性卵巢癌中的作用。结论:1.钙激活氯离子通道蛋白ANO1在人卵巢癌组织、血液及卵巢癌细胞中高表达,而在良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中低表达或检测不到表达,且其表达水平与癌组织的病理分期与分化程度呈正相关。以上结果表明ANO1在卵巢癌发生时高表达。2.沉默ANO1可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭能力以及小鼠荷瘤的生长。以上结果表明ANO1参与了卵巢癌的发生发展。3.在卵巢癌SKOV3及Caov-3细胞系中抑制ANO1的表达能降低Akt磷酸化水平。用抑制剂LY294002阻断Akt信号通路能抑制ANO1的促肿瘤细胞生长作用。以上结果表明ANO1通过PI3K-Akt通路发挥作用,ANO1可作为防治卵巢癌的靶点。