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Wnt蛋白家族是一系列富含半胱氨酸的分泌蛋白,调控多种生命活动:包括胚胎发育、细胞迁移及细胞分化。Wnt配体在哺乳动物体内通过以下两种机制发挥作用:Wnt/β-连环蛋白通路及非经典信号通路。Wnt5a通过上述两种作用机制参与发育、增殖及细胞分化。
动物实验研究显示,Wnt5a在泄殖腔膜周围间质中表达,而且Wnt5a表达下调导致大量与泄殖腔或后肠发育密切相关的信号分子表达或分布异常,这些信号分子包括Shh(sonichedgehog),Hoxa13,Fgf8(fibroblastgrowthfactor8)。此外,Wnt5a基因敲除小鼠表现出严重的肛门直肠畸形,如:直肠尿道瘘及肛门闭锁等。上述研究证明了Wnt5a在后肠及肛门直肠形态发生中起一定的作用,并为我们进一步研究Wnt5a在肛门直肠发育过程中的潜在作用机制及分子理论奠定了基础。
然而,目前尚无关于WNT5A在人类泄殖腔、后肠及肛门直肠形态发生过程中表达模式的研究。WNT5A是否参与人类泄殖腔的发育;WNT5A在人类胚胎后肠及肛门直肠的发育过程中是否发挥作用尚不清楚。因此,为了明确WNT5A在人类后肠及肛门直肠形态发生过程中的表达方式及可能发挥的作用,我们应用免疫组化的方法系统的研究WNT5A在人类肛门直肠发育的关键期即胎龄4～9周的时空表达模式。
实验方法：
一、标本
1、本研究遵守赫尔辛基宣言,并且经过中国医科大学盛京医院伦理委员会批准后进行。收集因意外妊娠而人工流产,发育正常的人胚胎标本107例(每例标本均取得产妇本人同意)。根据产妇末次月经时间、超声所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄为4～9周。标本经0.01MPBS液冲洗后立即置于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中4℃固定12小时～24小时,常规脱水,石蜡包埋,进行矢状面连续切片,厚度4μm。
2、标本立即经PBS(phosphate-bufferedsaline;pH7.4)冲洗后,4％多聚甲醛固定,常规方法脱水,制各蜡块,行矢状面连续切片。
二、试剂
1、WNT5A单克隆抗体购自美国SantaCruz公司;
2、免疫组化UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(产品编号kit-9701,kit-9709),多聚赖氨酸、DAB显色剂等购自福州迈新生物技术开发有限公司。
三、方法
通过免疫组化染色试验方法连续观察WNT5A在人类胚胎泄殖腔、尿生殖窦以及肛门直肠时空性表达模式。
结果：
第4周时,典型的泄殖腔形态已出现,U型的尿直肠隔将泄殖腔分隔为腹侧的尿生殖窦和背侧的原始直肠(后肠)。免疫组化显示WNT5A大量表达于尿直肠隔顶端上皮、后肠及泄殖腔膜。尿生殖窦及尿直肠隔腹侧上皮免疫反应几乎阴性。
第5周时,尿直肠隔继续下降,其顶端与泄殖腔膜的距离逐渐减小。此时WNT5A的表达方式与第4周时相似。
第6周时,泄殖腔管极为狭窄,但未观察到尿直肠隔与泄殖腔膜融合。尿直肠隔顶端上皮及后肠WNT5A表达持续强阳性。此时,直肠粘膜出现WNT5A弱阳性表达。尿生殖窦及尿直肠隔腹侧上皮免疫组化反应仍为阴性。泄殖腔膜逐渐延伸变薄,但WNT5A阳性细胞数量明显减小。
第7周时,泄殖腔膜继续延伸,变得极薄。在尿直肠隔顶端上皮、后肠及泄殖腔膜WNT5A表达减弱。尿生殖窦及尿直肠隔腹侧上皮免疫组化反应仍为阴性。泄殖腔膜破裂后,肛门直肠及尿生殖窦与羊膜腔相通,WNT5A阳性细胞立即在肛管上皮消失。相反,此时,在尿道上皮、腹侧泄殖腔膜及腹侧尿直肠隔出现WNT5A强阳性反应。
第8周时,尿道上皮、腹侧泄殖腔膜及腹侧尿直肠隔WNT5A表达仍然强阳性。肛管上皮阴性。
第9周时,肛门直肠继续发育,肛管部位WNT5A表达阴性。
结论：
在人类肛门直肠发育过程中(胎龄4～7周),WNT5A在泄殖腔膜、背侧尿直肠隔以及后肠上皮表达阳性;当肛门直肠形成后,WNT5A在肛门区域不再表达,提示WNT5A在人类肛门直肠发育过程中可能发挥重要作用。