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布鲁菌病(Brucellosis)作为一种在世界范围内危害严重的人畜共患病,具有重要的兽医公共卫生意义。为建立一种牛布鲁菌病快速可靠的血清学检测方法,本论文在对其三种外膜蛋白原核表达的基础上进行了基于重组蛋白混合抗原的酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)研究,具体如下：根据GenBank中登录的编码牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的基因序列,以布鲁菌A544株基因为模板,分别设计了3对特异性引物,利用PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因分别克隆到pCold-TF原核表达载体系统中,经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定正确后进行IPTG诱导重组蛋白的表达、重组蛋白的SDS-PAGE分析与Western blot鉴定,并利用亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,结果成功扩增出534 bp、639 bp和753bp的编码牛布鲁菌外膜蛋白OMP19、OMP22、 OMP28的基因序列,并克隆到pCold-TF原核表达载体构建了3种蛋白基因的重组表达质粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28。诱导表达的3种重组蛋白分别为69kD、74 kD和80 kD,均为可溶性蛋白,Western blot显示均有良好反应原性。利用亲和层析技术对三种重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的蛋白。将三种重组蛋白按浓度比,等比例混合作为包被抗原,经过优化包被条件、封闭条件、反应温度和时间等初步建立了牛布鲁菌感染抗体检测的间接酶联免疫吸附方法(indirect ELISA, iELISA),并进行了实验室保存的300份临床样品检测应用,同时进行虎红平板凝集实验(RBPT),同类进口商品化试剂(IDEXX)的平行检测。结果显示建立的iELISA方法,最佳的混合抗原浓度为(1:1:1)μg/ml,最适封闭液为10%马血清,最适一抗稀释度为1：200,二抗稀释度为1：20000。该方法特异性良好,不与小肠结肠炎耶尔森菌诊断血清和大肠杆菌诊断血清发生交叉反应。300份临床血清样品检测结果显示虎红平板凝集试验(RBPT)检测62份为阳性,238份为阴性;以RBPT检测结果为标准,IDEXX试剂盒检测62份阳性血清中60份为阳性(假阴性2份),敏感率为96.78%(60/62)： 238份阴性血清中236份为阴性(假阳性2份),特异率为99.16%(236/238),总符合率为98.67%(296/300)。混合抗原rOMPs-ELISA法检测结果为,62份阳性血清中58份为阳性(假阴性4份),敏感率为93.5%(58/62);238份阴性血清中230份为阴性(假阳性8份),特异率为96.64%(230/238),总符合率为96%(288/300),为下一步布鲁菌抗体检测间接ELISA方法的商品化和应用奠定了基础。