背景与目的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)一直是临床上倍受关注的重症疾患之一,其进展迅速,后果严重,其发病率正逐年上升,病死率虽然较前降低,但仍然较高,给人民的身体健康带来了巨大的危害,也增加了社会负担。心肌梗死患者极易发生室性心律失常或恶性心律失常或猝死,目前普遍认为其发生机制除与心肌细胞兴奋性异常有关外,电耦联障碍及传导异常也是主要原因。心脏缝隙连接(gap junction, GJ)通道是心肌细胞之间实现电偶联及化学信息交换的重要结构基础,而连接蛋白43(conHexin43,Cx43)是构成心肌缝隙连接通道特别是心室肌缝隙连接通道的主要连接蛋白(connexin, Cx),在数量、分布等方面若发生改变(Cx43重构)时必然会引起心肌细胞间电耦联障碍及传导异常。因此,心肌梗死后连接蛋白43重构是室性心律失常及恶性心律失常发生的分子解剖学基础。如能在心肌梗死早期采取积极的手段来干预连接蛋白43重构,可能对防治心律失常甚至猝死的发生起到更为积极的作用.连接蛋白43是心室肌细胞间缝隙连接的主要连接蛋白,在电子显微镜下,连接蛋白43主要在闰盘呈簇状分布于细胞的端对端连接处,每6个相邻细胞间的连接蛋白43构成跨膜连接小体(connexon),数十个小体排列在细胞膜构成缝隙连接(gap junction, GJ)。该区富含特殊的连接通道,故将这些通道称为缝隙连接通道(gap junction, GJ)。它具有亲水性、低选择性和低电阻等特点,是心肌细胞之间保持正常通讯及化学信息交换的重要结构基础,主要作用是形成细胞间快速的电冲动传导.保证心脏整体电活动同步性与协调性。由相邻细胞膜之连接蛋白(connexin, Cx)六聚体铆接成的细胞间低电阻通道即为心肌细胞缝隙连接(gap junction, GJ),是细胞间电导与传导速度的主要决定因素。虽然离子通道的功能改变是心律失常发生的一个重要因素,但不正常的细胞耦联有时起主要作用,如心肌梗死,肥厚梗阻性心肌病,心脏淀粉样变性等,由激动传导异常引起的折返性心律失常。因此,研究心肌梗死时缝隙连接分布的改变对于阐明心律失常的发生机制有重要意义。在哺乳动物心肌,虽然可有多种连接蛋白表达,但主要是连接蛋白43。因此研究连接蛋白43的数量和分布基本上可反映缝隙连接的数量和分布。本研究旨在通过免疫组织化学法染色观察,比较心肌梗死时缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的分布特征,探讨连接蛋白43在冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死的变化规律及其诊断意义。方法实验从青岛市立医院2007年至2009年间尸体解剖工作中挑选保存的心脏标本30例,标本诊断均符合世界卫生组织关于冠状动脉粥样硬化性心脏病猝死的标准,冠状动脉狭窄以管腔面积的缩小分为4级进行分析。Ⅰ级病变：管腔面积缩小1％-25%；Ⅱ级病变：管腔面积缩小26％～50%；Ⅲ级病变：管腔面积缩小51％～75%；Ⅳ级病变：管腔面积缩小76%-100%。将其中的冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死猝死者15例设为实验组,男性11例,女性4例,另外根据取材部位不同,将梗死区定为B组,梗死区边缘设定为C组,非梗死区设定D组。另外选择15例与实验组年龄相近的暴力死亡与非冠状动脉粥样硬化性心脏病猝死病例定为对照组A组男性9例,女性6例。在实验组冠状动脉粥样硬化性心脏病伴心肌梗死中,取每例左心室部位上的心肌梗死区(infarctus zone).心肌非梗死区(noninfarctuszone)以及梗死区边缘(border zone)各一块。由于连接蛋白43均匀分布在心室肌各层,因此,在对照组各病例中左心室取一块心室肌做为分析对照。用生理盐水清洗去心肌附着物,放入10%的甲醛溶液中固定24小时,取出后进行流水冲洗10分钟后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片,片厚4μm,每个标本各取15片,用免疫组化SABC法进行免疫组织化学染色：切片常规脱蜡至水,然后用3%H202灭活内源性酶,然后热修复抗原,然后用复合酶消化暴露抗原,然后用正常兔血清封闭然后滴加Cx43抗体然后生物素化山羊血清然后SABC,再用DAB显色,在上述步骤间均用PBS洗涤5分钟,然后脱水,透明,中性树胶封片,光镜观察；染色过程中另用PBS缓冲液替代一抗作为空白对照。每张切片随机编号,在盲法下进行评价。采用免疫组织化学染色阳性细胞记数,在高倍视野(×400)下随机选择5个视野,依次计数每个视野内连接蛋白43阳性的缝隙连接数,并计算连接蛋白43阳性的缝隙连接总数。然后再测量各视野中的阳性产物面积,根据细胞内阳性蛋白表达面积的半定量实验数据用均数±标准差(x±s)表示,应用北航MAIS病理图像分析系统分析缝隙连接中连接蛋白43阳性表达,统计实验数据。结果1.大体观察实验组冠状动脉粥样硬化性心脏病猝死伴心肌梗死心脏标本中,男性11例,女性4例(平均年龄45岁)。发现实验组心脏普遍增大,左心室壁增厚。这其中发生了心脏破裂的有2例,前壁破裂1例破裂部位在室间隔1例,其中1例破裂区伴有心肌出血。8例心脏肥大扩张,6例心脏有左室前壁、侧壁、室间隔、左室后壁心肌梗死,并且有陈旧性病灶并存；而其余9例有局灶性心肌梗死病灶,并合并心肌出血。每个病例都伴有1支或1支以上冠状动脉狭窄≥75%,合并冠状动脉内出血、破裂等。在年龄相近的对照组中,男性9例,女性6例(平均年龄43岁),心脏大体检查均没有发现心脏增大,亦无冠状动脉狭窄与缺血等发现。从死亡至尸检时间,实验组6-50 h(平均24 h),对照组8-32 h(平均22 h)2.心脏HE染色镜下可发现实验组均有不同程度的冠状动脉粥样硬化,其中部分病例有胆固醇结晶体及钙盐沉积；发现心肌间质扩张、瘀血的有8例；发现乳头肌心肌纤维断裂的有6例；不同程度的心肌变性、坏死在各例中都有发现,内检见心肌陈旧性疤痕组织,其中可发现有不同程度的心肌纤维断裂,心肌闰盘结构消失。而在对照组中,心肌结构基本是正常的,仅有少量病例在心肌外膜发现有局部少量心肌出血,心肌细胞之间的闰盘结构清晰可见。3.Cx43免疫组化染色正常心肌(对照组)可见排列有高度的规律性的磷酸化连接蛋白43集中于心肌闰盘处；在心肌纤维长轴垂直的细胞端端相连的部位可见缝隙连接呈簇状分布,而仅有少数缝隙连接位于与心肌纤维长轴平行的细胞侧侧相连的部位；在心肌各层中连接蛋白43均有密集分布,没有发现连接蛋白43密度显著增高或降低的区域在冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死猝死病例(实验组)中,不同心肌部位的缝隙连接蛋白Cx43阳性表达差异性比较大。与正常心肌相比连接蛋白43的分布在梗死病灶及其邻近区域出现显著紊乱,连接蛋白43在一部分梗死中心区域已经完全消失,而一部分梗死中心区连接蛋白43有一部分连接蛋白发生了重新分布,散在分布于细胞质中；在边缘带与坏死区邻接处绝大部分连接蛋白43已消失,只有极少数连接蛋白43分布于心肌细胞侧-侧相连处。可见许多岛状、半岛状的尚存活心肌在边缘带附近,一些连接蛋白43散在分布于心肌细胞侧-侧相连处。此外,在非梗死处心肌在形态学上还算正常的(可能是存活的),但细胞之间的闰盘连接蛋白43重度损坏崩解,尤其是细胞端-端相连处的连接蛋白43几乎完全消失,而重新散在紊乱分布于细胞侧-侧相连处。结论冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死猝死时心肌梗死病灶及其邻近区域连接蛋白43的数量及分布的高度不均一性是发生猝死性心律失常的结构基础,同时表明在诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死猝死时,脱磷酸化连接蛋白43具有非常重要的诊断价值。