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一、背景胆道并发症严重影响肝移植受体的生存及生活质量,并被公认为肝移植的薄弱环节(Achilles’heel)。随着外科操作技巧的提高,由手术者本身技术原因的胆管吻合口并发症已明显减少,而与非外科技术因素相关的胆管非吻合口狭窄则成为当前移植肝胆道并发症的主要成分之一,其中胆道的缺血-再灌注(CPR)对胆管上皮细胞(BEC)的损伤是并发胆管非吻合口狭窄的高危因素。BEC是衬于胆管树内壁的上皮细胞,在人类,4-5个BEC即可直接环绕成一个小胆管,大胆管的上皮粘膜则由更多的BEC排列而成,其下为纤维组织层,内含许多成纤维细胞。在正常情况下,成纤维细胞通常处于细胞周期的静止期,当其受到某些损伤、刺激或邻近细胞分泌的转化生长因子-β1(TGF-β1)等细胞因子的影响下,则会发生活化而转化为肌纤维母细胞(MFB),后者的持续出现和聚集是器官纤维化的关键过程。做为只占肝脏细胞总数不到5%的BEC,大部分亦处于细胞周期的休眠状态,在急慢性损伤等情况下,则发生以细胞丧失(凋亡、消溶)和增殖为特征的病理性改变。残存BEC的增殖虽然是对缺血-再灌注损伤(CPRI)做出的修复性反应,并且最终有可能恢复到近似原先的细胞状态,但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列的改变而具有和正常细胞不同的功能,例如分泌多种细胞因子如白介素(IL)-6、TGF-β1等,并表达多种细胞因子、趋化因子和血管生成因子的受体。因此,BEC不再是传统观点认为的那样只是肝内事件的旁观者,而是通过复杂的自分泌与旁分泌机制与其周围的多种肝内细胞例如成纤维细胞、MFB等发生密切联系,共同参与胆管周围纤维化、胆道狭窄等多种肝胆疾病的病理过程。白介素(IL)-6是一种较强的促有丝分裂原,在肝内主要通过信号转导和转录激活因子-3(STAT3)来调控细胞的增殖。目前虽无明确资料表明,IL-6/STAT3信号通路能介导移植肝BEC的增殖,但已有研究发现BEC拥有活化IL-6/STAT3信号通路的完整机制,并且CPRI诱导移植肝内IL-6mRNA表达上调。因此我们推测:IL-6/STAT3信号通路可能是介导移植肝BEC增殖的分子机制,通过对该信号通路的干预来调控移植肝BEC的增殖,观察对管周成纤维细胞活化的影响,从一个全新的角度出发,有可能为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆道狭窄等并发症提供了相应策略。同时我们也有理由相信,作为STAT3特异性抑制剂的雷帕霉素(RPM),通过部分阻断IL-6/STAT3信号通路而获得其它免疫抑制剂所无法比拟的抗纤维化特点,因而在肝移植领域将会拥有更为广泛的应用前景。二、目的BEC作为一种对CPRI较为敏感的细胞,在CPRI诱导下发生活跃增殖,极有可能参与移植肝胆道并发症的病理过程。本研究在建立一种适于移植肝胆道问题研究的大鼠肝移植模型基础上,通过观察CPRI诱导的移植肝BEC增殖对管周成纤维细胞活化的影响,旨在揭示IL-6/STAT3信号通路在移植肝胆管周围纤维化、胆道狭窄等并发症中的重要作用,并为新型免疫抑制剂雷帕霉素在肝移植领域的广泛应用提供有力的理论支持。三、方法与结果1.重建肝动脉血供的ROLT模型的建立与评估:在经典“双袖套”法的基础上,将供、受体肝总动脉以改良的“Gao支架法”直接对合,重建肝动脉血供;在此基础上将供肝在4℃UW液中分别冷保存1、12h,观察术后14d生存率及肝内胆管损伤的病理生理学变化。结果显示:供肝冷保存12h术后的OLT受体鼠14d生存率为40%,肝脏损伤较重,汇管区炎症细胞浸润,胶原纤维分布较多。2. CPRI诱导的BEC增殖对管周成纤维细胞活化的影响:在上述动物模型建立的基础上,观察CPRI对移植肝BEC形态及功能方面的影响,以及BEC周围成纤维细胞的活化情况。结果显示,CP12h组BEC凋亡和增殖现象明显,伴以血清ALT、ALP、TBIL等酶谱升高为特征的肝功能损害和胆汁郁积征象。增殖的BEC分泌TGF-β1促进成纤维细胞活化,表现为BEC周围MFB的大量聚集。3. IL-6/STAT3信号通路对大鼠移植肝BEC增殖的调控作用:通过给予肝移植受体鼠重组人IL-6(rhIL-6)和RPM处理,观察IL-6/STAT3信号通路对BEC增殖的调控作用,以及RPM对移植肝BEC增殖的影响。结果显示:CP12h组移植肝IL-6mRNA表达上调,BEC内STAT3活化增加,促进BEC增殖并伴随着管周MFB的持续聚集。RPM作为STAT3的特异性抑制剂,通过部分阻断细胞内的IL-6/STAT3信号通路,抑制由CPRI诱导的移植肝BEC的活跃增殖,减少BEC周围MFB的聚集,从而延缓肝移植术后胆管周围纤维化、胆道狭窄等并发症的发展,是一种具有广泛应用前景的新型免疫抑制剂。四、结论1.在传统“两袖套法”基础上,采用改良的“支架法”进行受体肝动脉血流重建,在此基础上将供肝冷保存12h的大鼠肝移植模型是观察胆道CPRI的理想模型。2.供肝较长时间的冷保存严重损伤BEC,诱导细胞凋亡并发生增殖,伴随着明显的肝功能损害及胆汁郁积征象。增殖的BEC通过分泌TGF-β1,诱导胆管上皮周围成纤维母细胞活化而发生向MFB的表型转化,有可能是肝移植术后胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症发生的关键因素。3. IL-6/STAT3信号系统的活化可能是CPRI诱导的移植肝BEC活跃增殖的分子机制之一。4.作为一种高效、低毒性的新型免疫抑制剂,RPM不仅可与其它免疫抑制剂协同应用于器官移植领域,由于它能部分阻断细胞内的IL-6/STAT3信号通路,抑制CPRI诱导的移植肝BEC的过度增殖,从一个全新的角度出发,有可能为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆道狭窄等并发症提供一定的理论依据,从而具有广泛的临床应用前景。