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【背景】
乙苯是潜在的耳毒性化学物之一，可对听觉外周造成不良影响。与内毛细胞相比，耳蜗外毛细胞对乙苯更为敏感。既往动物实验显示乙苯可导致大鼠听力阈值增加，耳蜗毛细胞减少；同时接触乙苯和噪声的劳动者听力损伤发生率高于单独噪声暴露的工人。有研究表明，氧化应激可以上调凋亡相关基因，诱导细胞凋亡。Nrf2/HO-1通路的活化能抑制氧化应激，保护细胞免受损伤。乙苯诱导HEI-OC1损伤可能与氧化应激有关，但其中的机制仍有待阐明。
【目的】
本研究拟探讨乙苯染毒后HEI-OC1细胞凋亡情况和Nrf2/HO-1通路中Nrf2、HO-1mRNA和蛋白表达水平的变化，为乙苯耳毒性和致听力损失的分子机制研究提供实验基础。
1.建立乙苯致HEI-OC1细胞损伤的体外模型，评估乙苯对细胞氧化损伤和凋亡的影响。
2.探究Nrf2/HO-1通路对乙苯诱导HEI-OC1细胞损伤的影响及可能机制。
【方法】
分别设置0、30、60、90、300、600、900μM；3、6、9、10mM共十一个浓度组，CCK-8法测定乙苯染毒24h后HEI-OC1细胞增殖活性；以0、1、2、4、8、16、32、64mM乙苯染毒液处理HEI-OC1细胞24h，计算乙苯的半数抑制浓度IC50，确定乙苯染毒的适宜浓度用于后续实验。用0、6、9和12mM浓度的乙苯染毒HEI-OC1细胞24h后，提取细胞总蛋白，用试剂盒测定细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px酶活力。通过流式细胞仪用AnnexinV-APC/PI双染法检测凋亡情况。提取细胞总RNA，经反转录形成cDNA，qPCR实验检测乙苯染毒后细胞内Nrf2、HO-1mRNA的表达。用蛋白印迹实验测定HEI-OC1细胞Nrf2、HO-1蛋白的表达水平。
【结果】
1.乙苯对HEI-OC1细胞的半数抑制浓度为12.86mM(R2=99.05)。随着乙苯染毒浓度的增加，细胞存活率下降。
2.DMF≥90μM可抑制HEI-OC1细胞增殖，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，后续实验中DMF的浓度设置为60μM。60μMDMF和9mM乙苯联合暴露HEI-OC1细胞存活率高于9mM乙苯染毒组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
3.以0、6、9、12mM乙苯处理HEI-OC1细胞24h，丙二醛含量分别为72.13±10.55、82.21±5.43、101.4±5.25和163.1±11.76nmol/mgprot，差异具有统计学意义(F=65.11，P＜0.01)；两两比较结果显示，除了6和9mM浓度组，其他各组均数差异均具有统计学意义(P＜0.05)。超氧化物歧化酶活力依次为30.56±3.14、25.14±0.68、28.26±3.09和21.44±3.02U/mgprot，差异具有统计学意义(F=6.48，P＜0.05)；两两比较结果显示，12mM浓度组与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。谷胱甘肽过氧化物酶活力分别为740.64±25.91、527.82±7.45、661.95±118.33和354.30±17.50U/mgprot，差异具有统计学意义(F=22.85，P＜0.01)。两两比较结果显示，12mmo/L浓度组与6、9mmol/浓度组相比，差异显著(P＜0.05)。
4.与对照组相比，6、9和12mM三个处理组的早期凋亡细胞占比分别增加了2.93倍、4.23倍及6.08倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)；两两比较结果显示，除6mM浓度组与9mM浓度组外，其他组别的差异具有统计学意义(P＜0.05)。晚期凋亡的细胞占比分别增加了2.18倍、3.38倍和5.54倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)。两两比较结果显示，除对照组与6mM浓度组、6mM浓度组与9mM浓度组外，其他组别的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
5.与对照组相比，12mM的乙苯处理细胞24h后，Nrf2和HO-1mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。两两比较结果显示，与对照组相比，12mM浓度组Nrf2mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与6mmo/L浓度组相比，12mmo/L浓度组Nrf2mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；12mM浓度组的HO-1mRNA表达水平低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
6.与对照组相比，9、12mM浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着乙苯染毒浓度的增加，Nrf2和HO-1蛋白的表达呈下降趋势。两两比较结果显示，与6mmol/L浓度组相比，9、12mM浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平呈下降趋势，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7.与对照组相比，9mM乙苯诱导组、60μMDMF和9mM乙苯联合暴露组的细胞早期凋率分别增加了8.05倍和5.63倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。两两比较结果显示，9mM乙苯诱导组细胞的早期凋亡率高于DMF、乙苯的联合暴露组，但差异没有显著的统计学意义(P＞0.05)。
8.DMF和乙苯的联合暴露组Nrf2和HO-1mRNA表达水平高于对照组和9mM乙苯染毒组，差异没有显著的统计学意义(P＞0.05)；HO-1蛋白的表达水平高于对照组和9mM乙苯染毒组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
【结论】
1.乙苯抑制HEI-OC1细胞的增殖，导致与氧化应激和凋亡有关的细胞损伤。
2.Nrf2/HO-1通路的活化能抑制细胞凋亡，上调抗氧化基因的表达，拮抗乙苯对HEI-OC1细胞的毒性作用。
乙苯是潜在的耳毒性化学物之一，可对听觉外周造成不良影响。与内毛细胞相比，耳蜗外毛细胞对乙苯更为敏感。既往动物实验显示乙苯可导致大鼠听力阈值增加，耳蜗毛细胞减少；同时接触乙苯和噪声的劳动者听力损伤发生率高于单独噪声暴露的工人。有研究表明，氧化应激可以上调凋亡相关基因，诱导细胞凋亡。Nrf2/HO-1通路的活化能抑制氧化应激，保护细胞免受损伤。乙苯诱导HEI-OC1损伤可能与氧化应激有关，但其中的机制仍有待阐明。
【目的】
本研究拟探讨乙苯染毒后HEI-OC1细胞凋亡情况和Nrf2/HO-1通路中Nrf2、HO-1mRNA和蛋白表达水平的变化，为乙苯耳毒性和致听力损失的分子机制研究提供实验基础。
1.建立乙苯致HEI-OC1细胞损伤的体外模型，评估乙苯对细胞氧化损伤和凋亡的影响。
2.探究Nrf2/HO-1通路对乙苯诱导HEI-OC1细胞损伤的影响及可能机制。
【方法】
分别设置0、30、60、90、300、600、900μM；3、6、9、10mM共十一个浓度组，CCK-8法测定乙苯染毒24h后HEI-OC1细胞增殖活性；以0、1、2、4、8、16、32、64mM乙苯染毒液处理HEI-OC1细胞24h，计算乙苯的半数抑制浓度IC50，确定乙苯染毒的适宜浓度用于后续实验。用0、6、9和12mM浓度的乙苯染毒HEI-OC1细胞24h后，提取细胞总蛋白，用试剂盒测定细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px酶活力。通过流式细胞仪用AnnexinV-APC/PI双染法检测凋亡情况。提取细胞总RNA，经反转录形成cDNA，qPCR实验检测乙苯染毒后细胞内Nrf2、HO-1mRNA的表达。用蛋白印迹实验测定HEI-OC1细胞Nrf2、HO-1蛋白的表达水平。
【结果】
1.乙苯对HEI-OC1细胞的半数抑制浓度为12.86mM(R2=99.05)。随着乙苯染毒浓度的增加，细胞存活率下降。
2.DMF≥90μM可抑制HEI-OC1细胞增殖，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，后续实验中DMF的浓度设置为60μM。60μMDMF和9mM乙苯联合暴露HEI-OC1细胞存活率高于9mM乙苯染毒组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
3.以0、6、9、12mM乙苯处理HEI-OC1细胞24h，丙二醛含量分别为72.13±10.55、82.21±5.43、101.4±5.25和163.1±11.76nmol/mgprot，差异具有统计学意义(F=65.11，P＜0.01)；两两比较结果显示，除了6和9mM浓度组，其他各组均数差异均具有统计学意义(P＜0.05)。超氧化物歧化酶活力依次为30.56±3.14、25.14±0.68、28.26±3.09和21.44±3.02U/mgprot，差异具有统计学意义(F=6.48，P＜0.05)；两两比较结果显示，12mM浓度组与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。谷胱甘肽过氧化物酶活力分别为740.64±25.91、527.82±7.45、661.95±118.33和354.30±17.50U/mgprot，差异具有统计学意义(F=22.85，P＜0.01)。两两比较结果显示，12mmo/L浓度组与6、9mmol/浓度组相比，差异显著(P＜0.05)。
4.与对照组相比，6、9和12mM三个处理组的早期凋亡细胞占比分别增加了2.93倍、4.23倍及6.08倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)；两两比较结果显示，除6mM浓度组与9mM浓度组外，其他组别的差异具有统计学意义(P＜0.05)。晚期凋亡的细胞占比分别增加了2.18倍、3.38倍和5.54倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)。两两比较结果显示，除对照组与6mM浓度组、6mM浓度组与9mM浓度组外，其他组别的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
5.与对照组相比，12mM的乙苯处理细胞24h后，Nrf2和HO-1mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。两两比较结果显示，与对照组相比，12mM浓度组Nrf2mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与6mmo/L浓度组相比，12mmo/L浓度组Nrf2mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；12mM浓度组的HO-1mRNA表达水平低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
6.与对照组相比，9、12mM浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着乙苯染毒浓度的增加，Nrf2和HO-1蛋白的表达呈下降趋势。两两比较结果显示，与6mmol/L浓度组相比，9、12mM浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平呈下降趋势，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7.与对照组相比，9mM乙苯诱导组、60μMDMF和9mM乙苯联合暴露组的细胞早期凋率分别增加了8.05倍和5.63倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。两两比较结果显示，9mM乙苯诱导组细胞的早期凋亡率高于DMF、乙苯的联合暴露组，但差异没有显著的统计学意义(P＞0.05)。
8.DMF和乙苯的联合暴露组Nrf2和HO-1mRNA表达水平高于对照组和9mM乙苯染毒组，差异没有显著的统计学意义(P＞0.05)；HO-1蛋白的表达水平高于对照组和9mM乙苯染毒组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
【结论】
1.乙苯抑制HEI-OC1细胞的增殖，导致与氧化应激和凋亡有关的细胞损伤。
2.Nrf2/HO-1通路的活化能抑制细胞凋亡，上调抗氧化基因的表达，拮抗乙苯对HEI-OC1细胞的毒性作用。