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奶牛是重要经济动物,在自然条件下其后代雌雄比例接近1∶1,然而乳用公牛育肥性较差、饲养回报率低,只有母牛有产奶性状,所以在生产中大量需要母牛,因此奶牛的性别控制具有重要的现实意义,性别决定机理的揭示也成为该领域的研究热点。哺乳动物性别决定过程是以SRY为主导的一系列相关基因参与的级联反应过程。SOX9(sex determining region Y-box 9)作为SRY下游最重要的调控信号因子,对生殖嵴分化、性腺形成、Sertoli细胞分化以及睾丸索的形成都起到十分重要的作用。本研究采用RACE技术获得了荷斯坦奶牛SOX9基因含完整编码区的序列,并利用生物信息学方法分别对牛SOX9基因核苷酸序列的同源性、染色体定位以及SOX9氨基酸序列、蛋白质的保守结构域、磷酸化和甲基化修饰位点和信号肽进行分析。另外建立了牛性别相关基因SRY、SOX9、DAX1、FOXL2 RNA水平的荧光定量检测体系,同时绘制出牛早期胎儿四个性别相关基因表达曲线,为从分子水平上控制奶牛性别提供理论基础。主要研究内容和结论如下:1)含完整编码区序列的牛SOX9克隆。以牛SOX9部分序列(AF278703)为基础,采用RACE技术克隆得到2846bp的含完整编码区的荷斯坦奶牛SOX9基因cDNA序列,并构建原核表达载体和真核表达载体。2) SOX9蛋白结构和功能的生物信息学分析。经Blast检索,证明牛SOX9序列为牛的一个新基因,经生物信息学分析预测其编码区序列为1575bp,编码产生524个氨基酸的蛋白,分子量为57.17334KD。牛SOX9基因定位于19号染色体上。3)利用T-A克隆方法构建牛四个性别相关基因SRY、SOX9、DAX1、FOXL2和内参基因GAPDH的标准质粒,并建立TaqMan荧光定量标准曲线。4)采用荧光定量PCR方法检测牛早期胎儿SRY、SOX9、DAX1、FOXL2基因在RNA水平的表达,结果显示雄性性别决定开始时间为35-39dpc(days post coitum,交配后天数)之间,雌性性别分化开始时间为39-41dpc之间,牛早期胎儿性别分化时在41-43dpc间完成性别决定;可见SRY是牛早期胎儿雄性性别决定基因,FOXL2可能担当雌性性别决定基因角色。