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聚乙烯醇（PVA）主要以1,3-二醇键的化学结构存在，是一种难于被降解的高分子化合物。PVA具有很多优良性能，在工业上得到广泛应用。然而，大量PVA废水排放到环境，导致严重的污染，因此，实现PVA的生物降解具有重要的现实意义。PVA脱氢酶（PVADH）催化PVA降解的第一步反应，本论文以Sphingopyxis sp.113P3PVADH为研究对象，详细研究该酶基因在大肠杆菌（E. coli）和毕赤酵母（P. pastoris）中的表达情况，并对该酶的应用进行初步研究，具体研究内容如下：（1）Sphingopyxis sp.113P3聚乙烯醇脱氢酶基因（PVADH）的人工合成及在大肠杆菌（E. coli）中的融合表达与包涵体复性。以Sphingopyxis sp.113P3PVADH的氨基酸序列为模板，按P. pastoris密码子偏好性并替换掉E. coli稀有密码子，合成1965bp的基因序列。聚合酶链式反应（PCR）扩增1887bp的成熟酶基因（mPVADH），并插入质粒pET32a（+），转化E. coli BL21（DE3）。以20oC、0.05mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、2%葡萄糖条件，诱导12h，目的蛋白仍以包涵体存在。通过包涵体复溶、稀释复性、重组肠激酶（rEK）切割、透析去除rEK和硫氧还蛋白（TrxA），纯化得到约67kDa的mPVADH蛋白，酶活和比酶活分别为60U/mL和109U/mg。（2）成熟PVADH在毕赤酵母（P. pastoris）中的高效表达、纯化和酶学性质研究。将mPVADH基因插入载体pPIC9K并电转化P. pastoris GS115，高拷贝转化子在摇瓶和3L发酵罐最高酶活分别为56和902U/mL，是首次在真核表达系统中成功表达PVADH。但是，表达的目的蛋白分子量小于预期，N-端氨基酸测序表明截短蛋白缺少mPVADH的1-81氨基酸。纯化的截短酶最适反应温度和pH分别为41-53oC和pH7.0-8.0；Ca2+对酶活有促进作用；催化最适底物（PVA1799）的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别是1.87mg/mL和34.9nmol/（min·mg）。（3）成熟PVADH在P. pastoris中截短表达分析。P. pastoris GS115/pPIC9K/mPVADH摇瓶诱导时，分别添加1%酪蛋白氨基酸、5g/L六偏磷酸钠；或将质粒pPIC9K/mPVADH转化P. pastoris SMD1168，表达的目的蛋白是截短的，说明不是胞外蛋白酶将目的蛋白降解。反转录PCR（RT-PCR）表明mPVADH转录时的mRNA是全长的，说明转录正确。分别缺失mPVADH截断位点前的ATG59、ATG64、ATG67和ATG76；或缺失mPVADH蛋白N端的1-21、22-51和52-81氨基酸，各突变转化子表达的目的蛋白仍然是截短的。同时，将绿色荧光蛋白（EGFP）与mPVADH融合，所得突变转化子表达的2段外源蛋白的分子量分别与EGFP和截短PVADH相当，说明融合蛋白翻译完整，但胞内蛋白酶将其错误切割。为了确定胞内蛋白酶对mPVADH的识别位点，首先针对蛋白酶Kex2的识别位点设计突变；然后针对其它蛋白酶，将mPVADH截断位点附近的氨基酸突变为（GlyGlyGlyGlySer）2，或缺失截断位点-5至+5的氨基酸序列，突变转化子表达的都是截短蛋白，说明不是Kex2错切mPVADH，该蛋白酶识别mPVADH的位点可能在截断位点后某区域，还有待于进一步研究。（4）截短PVADH（tPVADH）在P. pastoris中的过量表达与相关机制分析。将1644bp的tPVADH基因插入pPIC9K多克隆位点并转化P. pastoris GS115，转化子在摇瓶最高酶活为546U/mL，与表达mPVADH基因相比，酶活提高了10倍。荧光定量PCR（qRT-PCR）表明表达mPVADH的转录水平是表达tPVADH的1.9倍，但表达tPVADH基因时，胞外目的蛋白含量更多的原因可能是胞内蛋白酶对mPVADH错切影响了目的蛋白的分泌效率。在3L发酵罐上，分别优化了28和22oC诱导时的甲醇浓度，所得最高酶活分别是5515和8464U/mL；后者是文献报道的最高水平。低温诱导时，tPVADH的产量和生产强度大幅度提高归结于高细胞存活率、低胞外蛋白酶活力、高AOX酶活和高tPVADH转录水平。（5）tPVADH降解PVA1799的应用效果评价。红外光谱（IR）分析表明氧化型PVA（oxiPVA）的羰基在1735cm-1出现新吸收峰；1H-NMR表明在3.8ppm处出现新吸收峰，该峰对应的官能团是oxiPVA二酮基之间的α-次甲基基团，说明tPVADH的功能是催化PVA分子上相邻羟基生成β-二酮基。凝胶过滤色谱（GPC）检测发现，PVA1799和oxiPVA的粘度分子量（Mv）分别是154786和71564，而OPH水解产物中大分子物质已消失，说明oxiPVA能自降解，OPH能加快oxiPVA的降解。最后，tPVADH和OPH联合处理40g/L的PVA溶液，其粘度下降约15%，说明tPVADH和OPH联合应用对PVA有一定降解效果。