目的：　　胃癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，近年来，胃癌的发病率呈现下降趋势，但仍然被列为全球第四大最常见的癌症，其死亡率一直居高不下，占全球癌症相关的死亡数第二位，严重威胁人体的健康。虽然早期诊断和治疗有所进展，但胃癌患者根治性手术后肿瘤复发和转移仍是一种主要的导致死亡原因，预后难以令人满意。现在可用于胃癌预后的因素中，最重要的因素是胃癌术后TNM分期，然而，即使是处于同一分期的胃癌患者预后也存在显著差异。因此寻找判断胃癌预后的分子标志并加以干预是目前研究的热点和难点。　　在哺乳动物细胞中，丙酮酸脱氢酶(PDH)是以复合物的形式存在于在线粒体基质中，能够催化葡萄糖衍生的丙酮酸转化成乙酰-辅酶A，乙酰-辅酶A然后进入三羧酸(TCA)循环;在肿瘤细胞中，PDH活性受到抑制，而使肿瘤的代谢形式由线粒体的氧化磷酸化转为有氧糖酵解。因此，在能量代谢过程中，PDH作为糖酵解和线粒体糖氧化之间联系通道的开关酶。但人们陆续发现其除了参与能量代谢化反应外，还与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关。然而，PDH在肿瘤中表达的变化鲜见报道。PDH作为一个能量代谢链上的一个至关重要的酶，其失活或表达缺失可能与肿瘤的发生发展有关。　　乳酸脱氢酶A(LDH-A)是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，在糖酵解过程中的最后阶段乳酸生成的过程中起着至关重要的作用。目前有报道，过量的乳酸生成预示着胃癌患者不良的预后。因此， LDH-A作为糖酵解通路的关键酶，它的表达上调可能与肿瘤的生长、转移及患者的恶性预后密切相关。　　本文将应用免疫组化方法检测胃癌组织及癌周正常胃粘膜组织中PDH、LDH-A的表达与意义，并探讨其表达变化与临床病理参数和预后的相关性。与此同时，综合国内外研究进展的基础上，采用RNA干扰技术，以质粒为载体构建靶向LDH-A的siRNA，转染人胃癌细胞BGC-823干扰LDH-A的表达，观察抑制LDH-A的表达对胃癌细胞生长特征的影响，进一步佐证LDH-A的表达对胃癌预后的影响，希望为下一步的临床应用提供理论和实验依据。　　方法：　　一、检测胃癌组织及胃癌细胞系中PDH、LDH-A的表达　　（一）资料收集　　收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2006年1月至2007年5月手术切除的胃癌组织及癌旁非癌组织265例。研究对象包括194名男性和71名女性，平均年龄为59（范围29-81）岁，选取的所有患者术前均未接受化疗、放疗。收集所有患者的超过五年的随访信息。组织标本经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋后，切片常规伊红-苏木素染色后用于病理诊断，将选取的胃癌及癌周石蜡组织手工制成组织芯片(20×10)，4μm连续切片。培养正常胃粘膜细胞系GES-1和胃癌MKN28、AGS、 SGC-7901、BGC-823细胞系。　　（二）免疫组化、Western blot检测　　行StreptAvklin-Biotin Complex法（SABC法）免疫组化分析。采用卡方检验、Kaplan-Meier法、log-rank检验、Cox回归等统计方法分析PDH、LDH-A蛋白表达与临床病理特征及预后的关系，P＜0.05认为统计学上有显著意义，在正常胃粘膜细胞系GES-1和胃癌MKN28、AGS、 SGC-7901、BGC-823细胞系中检测LDH-A蛋白表达情况。　　二、LDH-A对细胞系生物学行为的影响　　（一）干扰载体的构建及转染　　1、针对LDH-A的ORF序列设计三条siRNA序列和一条阴性对照序列，分别构建表达这三个序列和阴性对照序列的pGPU6-GFP-siLDH-A重组质粒。　　2、通过脂质体转染试剂LipofectamineTM2000介导，将重组质粒导入人胃癌BGC-823细胞（LDH-A高表达细胞系），同时设立阴性对照组和野生对照组。转染后24h荧光显微镜观察细胞的转染效率;48h倒置显微镜观察细胞形态的变化。　　（二）干扰载体对LDH-A在胃癌细胞中表达的影响　　采用Western blot半定量检测方法从蛋白水平检测转染后siRNA对LDH-A的抑制效果。　　（三）干扰载体（干扰LDH-A的表达）对胃癌细胞增殖及侵袭的影响　　1、采用MTT实验检测转染pGPU6-GFP-siLDH-A重组质粒对人胃癌细胞BGC-823增殖活性的影响，分别计算转染后12h、24h、48h、60h细胞的生长率，观察重组质粒对细胞生长增殖的影响。　　2、采用划痕法Wound healing assay细胞迁移实验检测转染pGPU6-GFP-siLDH-A重组质粒的人胃癌细胞BGC-823迁移能力的改变。　　3、采用Transwell法基质胶细胞侵袭实验研究转染pGPU6-GFP-siLDH-A重组质粒的人胃癌细胞BGC-823侵袭能力的改变。　　结果：　　免疫组化染色显示PDH蛋白定位于细胞浆，在胃癌原发灶中的表达阳性率为55.47％，与癌旁非癌组织的53.58％无显著差异(P＞0.05)。PDH表达与劳伦斯分型，淋巴结转移，淋巴管浸润，组织学类型和TNM分期有关(P＜0.05)。生存分析Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验表明，PDH在胃癌组织中高表达患者预后明显优于低表达者(P＜0.001)。多因素分析（校正协变量包括年龄、Lauren分型、TNM分期、淋巴结转移、病理类型、肿瘤大小、肿瘤的侵袭深度和淋巴管浸润）显示PDH的表达在胃癌是一个独立预后因素(Hazard ratio=0.608，95％CI0.504-0.734,P＜0.001)。　　免疫组化显示LDH-A蛋白定位于细胞浆，在胃癌原发灶中的表达阳性率为76.14％，高于癌旁非癌组织62.68％(P=0.002)。LDH-A高表达与劳伦斯分型，和组织学类型相关(P＜0.05)。生存分析Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验表明，在弥散型胃癌和未分化胃癌中，高表达LDH-A胃癌患者预后明显低于低表达者(P＜0.001)，而肠型胃癌及分化型胃癌中生存曲线未见上述趋势。多因素分析（校正因素包括年龄、Lauren分型、TNM分期、淋巴结转移、病理类型、肿瘤大小、肿瘤的侵袭深度和淋巴管浸润）显示LDH-A在胃癌的表达是一个独立危险因素(Hazard ratio=1.829，95％CI1.375-2.4330，P＜0.001)。利用Western blot检测了正常胃粘膜细胞株GES-1和MKN28、AGS、SGC-7901、BGC-823胃癌细胞株LDH-A基因表达情况，结果显示LDH-A在AGS、BGC-823胃癌细胞株中的表达显著高表达，在MKN28及SGC-7901胃癌细胞株中呈中等量表达。而在非胃癌细胞株GES-1中LDH-A表达不显著。DNA测序证实成功构建了针对LDH-A基因的三条小干扰RNA重组质粒载体包括pGPU6-GFP-siLDH-A(980，506，376);重组质粒作用BGC-823细胞48h后，形态学可见野生组BGC-823，细胞贴壁生长旺盛，边界清楚，呈上皮样细胞形态，可见较多的核分裂相，而转染pGPU6-GFP-siLDH-A的细胞形态发生明显改变，细胞贴壁能力下降、密度降低、细胞变变圆、小、颗粒增多、碎片增加、并有脂滴形成。对照组细胞与野生型细胞形态上未见明显差别。转染效率约为40-60％。Western blot检测结果显示所构建的重组质粒载体对人胃癌BGC-823细胞中LDH-A的表达发挥了干扰作用，其中以LDH-A-siRNA(506)载体的干扰效果最强。MTT检测结果显示pGPU6-GFP-siLDH-A-506重组质粒对BGC-823细胞的增殖均具有明显的抑制效应，从转染后24h开始细胞增殖受到抑制，48时细胞增殖受抑制极为明显(p＜0.01);划痕法Wound healing assay细胞迁移实验检测转染pGPU6-GFP-siLDH-A重组质粒的人胃癌细胞BGC-823迁移能力明显减弱;Transwell基质胶细胞侵袭实验研究转染pGPU6-GFP-siALDH-A重组质粒的人胃癌细胞BGC-823，发现侵袭能力比未转染细胞减弱。　　结论：　　为了评价PDH表达的临床意义，我们采用大批量胃癌组织标本进行免疫组化染色，结果在256例患者胃癌组织中PDH表达有差异。尽管机制尚不清楚，却有足够的理由推断PDH作为一个能量代谢链上的一个至关重要的酶，其低表达可能与肿瘤的侵袭发展有关。此外，PDH表达也可以作为一个独立预后因素，其降低表达与较差的预后相关。　　LDH-A在胃癌组织中显著高表达，与癌组织周围正常黏膜组织有著差异。PDH蛋白表达升高与患者较高年龄和较低的组织学分化程度相关，而与其它临床病理特征如劳伦斯分型、淋巴结转移、淋巴管浸润、淋巴结转移、疾病分期无关。生存分析表明LDH-A高表达与胃癌患者的不良预后明显相关。本实验成功构建了LDH-A的shRNA真核表达质粒载体，并在脂质体的介导下分别转染人胃癌细胞株BGC-823(LDH-A基因高表达细胞株)，采用Western blot、MTT、细胞迁移实验等技术，比较研究了LDH-A基因沉默后对胃癌细胞生长增殖、凋亡和运动力的影响。结果表明，LDH-A蛋白在部分胃癌细胞系中显著高表达。构建的LDH-A-shRNA真核表达质粒载体能特异、高效地抑制胃癌细胞LDH-A蛋白的表达，并可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移运动力，从而降胃癌细胞的恶性表型。说明LDH-A可以促进人胃癌的发生、发展、转移，提示LDH-A可以作为独立危险因素成为判断胃癌预后的一个新的靶点。