【摘 要】
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近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命。利用该技术可以快速高效的对植物基因组进行定点编辑修饰,修饰后的植物体在当代就可获得纯合植株,同时通过自交或回交的方法可剔除外源载体序列,使得编辑后的植株与自然界的自发突变（自然变异）或人工诱变的突变体植株没有本质区别,因此,预计未来该技术对植物新品种培育具有重要意义。然而,目前为止对CRISPR/Cas9基因编辑技术
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近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命。利用该技术可以快速高效的对植物基因组进行定点编辑修饰,修饰后的植物体在当代就可获得纯合植株,同时通过自交或回交的方法可剔除外源载体序列,使得编辑后的植株与自然界的自发突变（自然变异）或人工诱变的突变体植株没有本质区别,因此,预计未来该技术对植物新品种培育具有重要意义。然而,目前为止对CRISPR/Cas9基因编辑技术培育的植株的非预期效应的安全评价研究却鲜有报道。本研究利用基因编辑技术对水稻千粒重基因TGW6进行编辑,进一步地选择阳性基因编辑材料通过自交,回交等手段构建一系列（HD、HD-I、HD-A、HD-B、HD-C、HD-D、HD-CH和HD-CB）稳定基因编辑材料。随后基于转录组、代谢组技术对上述水稻开展了非预期效应评价研究,为基因编辑水稻的非预期效应评价提供科学全面的数据支撑,分析CRISPR/Cas9系统在编辑过程中的潜在健康风险。主要研究结果如下:1.通过DNA提取,PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,再利用Sanger测序检测T3和T5代的基因型,证明经基因编辑的位点可稳定传至下一代,筛选相应基因型材料。对HD家系材料进行千粒重和粒长的测定,发现HD-I的千粒重与野生型HD相近,经基因编辑的T3代和T5代千粒重均比野生型HD提高5%以上,粒长提高3%以上,说明通过基因编辑手段对水稻TGW6位点进行修饰,具有提高水稻产量的潜力。2.分析HD家系中Cas基因和TGW6基因的相对表达量,PCR结果显示在HD、HD-I、HD-C、HD-D、HD-CH和HD-CB中未检测到Cas基因;Q-PCR结果显示TGW6基因相对表达量在野生型HD中显著高于其他处理的水稻,证明两种基因的相对表达量具有遗传稳定性。3.利用RNA测序（RNA-seq）进行基因编辑水稻的非预期效应研究:本研究对HD家系材料进行转录组测序,比较并分析HD-I/HD、HD-T3/HD、HD-T5/HD-T3、HD-T5/HD-C、HD-with-Cas/HD、HD without-Cas/HD、HD-with-Cas/HD-without-Cas 7个组合的转录组表达差异。通过对差异表达基因进行GO功能分析,这些差异表达基因按其功能主要归为生物学过程（Biological process）、细胞组分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）三类。对差异表达基因的GO功能和KEGG通路显著性富集分析,表明基因编辑并未给试验水稻带来明显的非预期效应,且这种非预期效应是安全的,且能稳定传代。4.利用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行基因编辑水稻的非预期效应研究:本研究对上述水稻品系代谢组进行了主成分分析（PCA）,并进行代谢物注释,KEGG注释结果显示本研究中的水稻代谢物所涉及的代谢通路主要归入新陈代谢（Metabolism）、遗传信息加工（Genetic Information Processing）、环境信息加工（Environmental Information Processing）三大类。通过KEGG通路富集确定差异代谢物参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径,检测到的差异代谢途径和差异代谢物积累均显示基因编辑水稻产生的不明显且安全的非预期效应。本研究的全部内容和结果初步证明了基因编辑技术的可靠性,为CRISPR/Cas9技术在植物育种和生物技术的应用中提供了重要基础,为更多基因编辑品种的非预期效应研究提供重要依据。
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