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牙周炎是口腔科常见疾病,是导致牙齿早失的主要原因。牙周炎以牙周支持组织包括牙槽骨的破坏为主要病理表现,其治疗以重建牙周组织,恢复牙周组织的结构和功能为目标。同其他部位的骨组织相同,牙槽骨终生处于骨改建中,即成骨细胞的骨生成和破骨细胞的骨吸收形成平衡,二者相对作用的强弱决定骨量的变化。牙周炎发生时,局部的炎症反应使成骨细胞的骨生成受到抑制,而破骨细胞的骨吸收作用被促进。牙周医学研究表明牙周炎发生及病变程度与心血管疾病密切相关,而高脂血症作为共同的致病因素同时促进了这两类疾病的发生。高脂血症以升高的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-c),甘油三脂(triglyceride, TG),总胆固醇(total cholesterol, TC)为主要表现,其中LDL-c升高被认为是心血管疾病的主要致病因素。高脂血症可引起脂质过氧化,LDL的氧化主要发生在动脉血管壁,产生多种具有生物活性的脂质氧化产物,在动脉粥样硬化斑块病变发生中起关键作用。其中低度氧化修饰的LDL (minimally modified LDL, MM-LDL)即LDL不完全氧化的产物,被认为具有更高的促炎能力。研究表明脂质氧化产物促进了血管细胞钙化,而抑制了成骨细胞钙化,可能是心血管疾病血管钙化和骨质破坏并发的机制。在牙周炎的发生发展中,脂质氧化产物一方面影响系统炎症水平和免疫状态,增加了机体对牙周炎的易感性；另一方面直接作用于成骨细胞及破骨细胞,促进骨吸收而抑制新骨生成,最终骨密度及骨量降低。研究发现多种脂质氧化产物参与抑制成骨前体细胞的分化及骨基质产生。氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-3-甘油-磷脂酰胆碱(oxidized1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, ox-PAPC)是具有生物学活性的,磷脂氧化产生的混合物,也简称为氧化磷脂,在体内由LDL氧化产生。MM-LDL的多种生物学作用是由ox-PAPC介导,因此ox-PAPC被认为是MM-LDL的主要活性成分。同其他脂质氧化产物相似,ox-PAPC可以抑制间充质干细胞成骨分化；在前成骨细胞MC3T3-E1中ox-PAPC抑制细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和钙的摄入。研究发现ox-PAPC可以下调骨形态发生蛋白-2(bone morphogenesis protein-2, BMP-2)和甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)诱导的成骨信号。但是,ox-PAPC对成骨细胞活性,成骨基因表达的影响及确切的分子机制尚不明确。Wnt是糖蛋白家族成员,Wnt信号通路在胚胎发育及成体生长中参与调节多种细胞的多种行为和功能。成骨因子如转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2、Runx2)和osterix,以及ALP,骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP),骨钙素(osteocalcin, OC)等的表达均可被Wnt信号激活。经典Wnt系统可以促进成骨细胞的成熟,抑制成骨细胞及骨细胞凋亡；而经典Wnt信号的失活,会引起成骨分化受阻,成骨抑制等。总之,经典Wnt信号系统在成骨分化和骨生成中起重要作用,然而其是否参与了脂质氧化产物包括ox-PAPC对成骨分化的影响目前尚无研究。基于以上研究背景,本实验研究ox-PAPC是否影响成骨细胞增殖,凋亡和成骨相关基因表达；同时观察重要的成骨调控信号——经典Wnt通路是否参与了上述ox-PAPC对成骨分化的影响及具体分子机制。材料和方法第一部分：ox-PAPC对成骨细胞活性及成骨相关基因表达的影响取新生小鼠颅骨,分离并培养原代成骨细胞,鉴定后取第二代细胞,常规培养并以0,15,30μg/ml ox-PAPC刺激,分别于刺激0,24,48,72,96小时用CCK-8法检测细胞活性；用含5%血清的培养基培养并以0,15,30 μg/ml ox-PAPC刺激48小时,用caspase-3活性检测评价细胞凋亡。分别培养小鼠原代成骨细胞及MC3T3-E1前成骨细胞系,以成骨培养基,同时以15μg/ml ox-PAPC或PAPC刺激3小时,1天,3天,5天,提取总RNA,采用实时定量反转录-聚合酶链式反应(real time reverse transcription-polymer chain reaction, real time RT-PCR)技术分析成骨因子Runx2, oxterix, ALP和OC的表达变化。第二部分：ox-PAPC对经典Wnt信号通路及其诱导的成骨分化的影响及作用机制1.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/ml Wnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15 μg/ml oxPAPC刺激1天,采用细胞免疫荧光技术及Western blot技术检测β-catenin的细胞核/浆分布,评价ox-PAPC对经典Wnt通路活性水平的影响。2.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/ml Wnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg/ml oxPAPC刺激2天,检测细胞内ALP活性；刺激2天和3天,采用Western blot法分别检测Runx2及BSP蛋白水平的变化,以分析ox-PAPC对经典Wnt信号诱导的成骨分化的影响。3.培养MC3T3-E1细胞,以15 μg/ml ox-PAPC刺激不同时间,采用Western blot技术检测总ERK,总p38 MAPK及p-ERK,p-p38 MAPK水平,研究ox-PAPC刺激后ERK通路及p38 MAPK通路活性的动态变化；然后以20 ng/ml Wnt-3a和/或15 μg/ml ox-PAPC刺激1小时,同样采用Western blot法检测总ERK,总p38 MAPK及p-ERK, p-p38 MAPK水平,研究Wnt-3a和ox-PAPC分别对ERK及p38 MAPK通路活性的作用。4.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/ml Wnt-3a,15 μg/ml oxPAPC加或不加ERK/p-38 MAPK通路抑制剂刺激细胞,同前述方法检测成骨因子的表达和活性变化以及经典Wnt信号通路的活性变化。结果第一部分：成功分离培养原代小鼠颅骨成骨细胞,并经免疫细胞化学染色鉴定BSP(+)；15和30 μg/ml ox-PAPC可促进原代成骨细胞增殖,并促进5%血清培养条件下成骨细胞凋亡；而15 μg/ml和30 μg/ml浓度组间细胞增殖及凋亡均未见明显差异。原代成骨细胞及MC3T3-E1细胞,ox-PAPC刺激组成骨相关因子osterix, Runx2, ALP和OC mRNA表达明显降低；而PAPC刺激组各基因表达均无明显变化。第二部分：1. MC3T3-E1对照组细胞核内β-catenin表达水平较低,核内{-catenin表达阳性细胞较少,经典Wnt信号通路未激活；经Wnt-3a刺激后,核内β-catenin表达阳性的细胞增多,细胞核/浆β-catenin比值升高；Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,免疫荧光显示核内P-catenin表达阳性的细胞较Wnt-3a单独处理组减少,western定量结果显示细胞核/浆β-catenin蛋白比值较Wnt-3a单独处理组明显降低。2.MC3T3-E1以Wnt-3a刺激2天后,ALP活性升高,而以ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激后,ALP活性较Wnt-3a单独处理组明显下降。同样,Wnt-3a刺激2天后Runx2蛋白水平及3天后的BSP蛋白水平升高,ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激组Runx2及BSP水平较Wnt-3a单独组均明显降低。3. MC3T3-E1经ox-PAPC刺激后,总ERK和总p38 MAPK水平无明显变化,而p-ERK及p-p38 MAPK的相对水平则高于对照组,其升高时间可持续至刺激后3小时。刺激1小时后,western结果显示ox-PAPC刺激明显升高p-ERK/ERK及p-p38 MAPK/p38 MAPK相对水平,而Wnt-3a对二者均无影响。4. MC3T3-E1经Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,β-catenin核内表达阳性的细胞数较Wnt-3a单独处理组减少,核内表达降低,ALP活性和Runx2, BSP蛋白水平较Wnt-3a单独处理组明显下降。以ERK通路抑制剂PD98059与Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激细胞,可以消除上述ox-PAPC对β-catenin核内转移的抑制作用,逆转了ox-PAPC引起的ALP活性及Runx2BSP蛋白表达水平下降,且与Wnt-3a单独处理组相比无显著差异。以p38 MAPK抑制剂 SB203580与Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激细胞,对β-catenin核内转移无影响,不能逆转ox-PAPC对Wnt-3a激活的成骨因子表达及活性的抑制作用,反而进一步降低ALP活性及Runx2蛋白表达水平。结论1. Ox-PAPC促进原代小鼠成骨细胞增殖,在低血清培养高细胞密度情况下促进细胞凋亡。Ox-PAPC抑制MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞内成骨相关因子osterix, Runx2和ALP, OC的mRNA表达；而PAPC对此无明显抑制作用。氧化磷脂对成骨分化和功能有抑制作用。2. Ox-PAPC抑制Wnt-3a激活的P-catenin核内转移,即抑制了经典Wnt通路激活；并抑制Wnt-3a激活的ALP活性及Runx2, BSP蛋白表达。ox-PAPC抑制经典Wnt信号诱导的成骨分化。3. Ox-PAPC激活ERK及p38MAPK通路,阻断ERK通路可以逆转ox-PAPC对经典Wnt通路及对Wnt-3a激活的成骨分化的抑制作用。Ox-PAPC对经典Wnt通路及Wnt-3a诱导的成骨分化的抑制是通过ERK通路激活实现。